La biogenèse mitochondriale et l’hyperactivation métabolique limitent l’application du test MTT dans l’… l’estimation de l’inhibition de la croissance radio-induite

Les changements dans la viabilité métabolique radio-induite ne sont pas corrélés avec l’inhibition de la croissance

En étudiant l’inhibition de la croissance radio-induite dans diverses lignées cellulaires en utilisant le test MTT et en comptant le nombre de cellules, nous avons constaté que les résultats obtenus à partir des tests basés sur la viabilité métabolique ne sont pas en corrélation avec le nombre réel de cellules à différents moments après l’exposition aux rayonnements. Le test MTT est largement utilisé parce qu’il représente réellement le nombre de cellules viables dans un échantillon donné2,3,4. Nous avons examiné ce test en comparant les valeurs MTT avec le nombre de cellules. Des cellules en croissance exponentielle ont été exposées à des rayonnements ionisants pour analyser l’inhibition de la croissance ainsi que la viabilité métabolique en dénombrant respectivement le nombre de cellules et la réduction du sel de tétrzolium en formazan (test MTT classique ; utilisé ici comme indice MTT). Les cellules ont d’abord été exposées à différentes doses de rayonnement ionisant (2, 3, 5 et 7 Gy) afin d’observer les changements dépendants de la dose de rayonnement et la corrélation entre le nombre de cellules et la viabilité métabolique. La quantité de formazan formée (c’est-à-dire l’indice MTT) 48 heures après l’irradiation dans les trois lignées cellulaires (A549, MDA-MB-231 et HeLa) a montré une réduction de 20 à 35 % (à 5 Gy et 7 Gy ; figures supplémentaires 1Ai à Ci) par rapport aux cellules non irradiées, tandis que la diminution du nombre de cellules était de l’ordre de 70 à 90 % (figures supplémentaires 1Aii à Cii). 1Aii à Cii), indiquant clairement un manque de corrélation entre la viabilité métabolique (indice MTT) et l’inhibition de la croissance (nombre de cellules) à toutes les doses de rayonnement ; les deux paramètres de réponse au rayonnement analysés.

En outre, pour examiner la généralité de cette observation, nous avons examiné la relation entre les changements dans le nombre de cellules (inhibition de la croissance) et l’indice MTT (viabilité métabolique) dans 7 lignées cellulaires non-tumorogènes et tumorogènes (NIH/3T3, Raw 264.7, HEK-293, HeLa, A549, MCF-7 et MDA-MB-231) à une dose unique (5 Gy), qui a induit une inhibition de la croissance de près de 50 % dans les trois cellules testées (figure supplémentaire 1). 24 heures après l’irradiation, toutes les lignées cellulaires évaluées ont montré soit une égalité avec le témoin, soit une augmentation de la valeur de l’indice MTT (Fig. 1Ai à Gi), à l’exception de Raw 264.7 (Fig. 1Bi), qui est relativement sensible aux rayonnements. D’autre part, une diminution significative du nombre de cellules a été notée dans ces conditions (Fig. 1Aii à Gii). 48 heures après l’irradiation, le nombre de cellules était significativement plus faible, allant de 43% (MDA-MB-231, Fig. 1Gii) à 76% (Raw 264.7, Fig. 1Bii) par rapport au contrôle, tandis que les valeurs de l’indice MTT ont montré une réduction de seulement 10% à 37% respectivement, avec un maximum dans la lignée cellulaire Raw264.7 (Fig. 1Bi). Lorsque les valeurs de l’indice MTT (Δ OD) ont été normalisées par rapport au nombre de cellules correspondant, elles ont montré une augmentation de la viabilité métabolique par cellule de 1,4 à 3 fois (dans différentes lignées cellulaires) (informations dérivées) à 24 et 48 heures, qui a encore diminué à 48 heures dans la plupart des lignées cellulaires, à l’exception des cellules Raw264.7, NIH/3T3 et HeLa, mais qui reste significativement plus élevée que le contrôle respectif (Fig. 1Aiii à Giii). Ces observations démontrent clairement que le nombre de cellules, qui est la véritable mesure de l’inhibition de la croissance et/ou de la cytotoxicité induite par les rayonnements, n’est pas en corrélation avec l’essai de viabilité métabolique à haut débit (MTT), largement utilisé pour l’évaluation rapide de la réponse aux rayonnements, ce qui semble être dû à l’augmentation de la viabilité métabolique induite par les rayonnements (Fig. 1Aiii à Giii) des cellules exposées.

L’exposition au rayonnement augmente la viabilité métabolique en augmentant la masse mitochondriale

L’augmentation de la viabilité métabolique dans les cellules exposées au rayonnement peut résulter soit d’une hyperactivité des mitochondries, soit d’une augmentation de la masse mitochondriale car la conversion du MTT en formazan se produit principalement au niveau des mitochondries7,8,9,10. On sait que les rayonnements ionisants induisent la masse et la fonction mitochondriales dans les cellules exposées20,21. Par conséquent, nous avons examiné si l’augmentation de la masse mitochondriale est responsable de l’augmentation de l’indice MTT dans les cellules exposées aux rayonnements en utilisant la cytométrie de flux. Conformément aux observations précédentes, nous avons constaté que la masse mitochondriale moyenne par cellule était significativement augmentée de près de 1,4 fois dans les cellules MCF-7 (minimum, Fig. 2Fi) à 4 fois dans les cellules Raw 264.7 (maximum, Fig. 2Bi) 24 et 48 heures après l’exposition aux rayonnements (Fig. 2Ai à Gi). Simultanément, dans les cellules irradiées, une production accrue de formazan par cellule a également été observée aux points de temps respectifs, quantifiée dans des conditions expérimentales similaires (Fig. 2Aii à Gii). Les images microscopiques prises 24 heures après l’exposition aux rayonnements montrent également un dépôt de formazan visiblement plus important dans les cellules irradiées que dans les cellules témoins (Fig. 2Aiii à Giii). Les corps contenant du formazan (mitochondries) dans les cellules témoins sont de couleur moins intense, peu nombreux et uniformément distribués dans le cytoplasme, alors que dans les cellules exposées aux rayonnements, ils sont de couleur sombre et regroupés dans la région périnucléaire (Fig. 2Aiii à Giii). Ces images microscopiques fournissent des preuves visuelles qui confirment l’indice MTT plus élevé ou la viabilité métabolique accrue par cellule dans les cellules irradiées. En outre, elles valident la façon dont un nombre réduit de cellules survivantes irradiées peut produire une quantité beaucoup plus élevée de formazan (densité de couleur) par cellule que les cellules témoins non traitées respectives, ce qui entraîne une fausse interprétation des données.

L’irradiation améliore la viabilité métabolique en induisant la biogenèse mitochondriale

La mitochondrie est le site principal où le MTT est réduit en Formazan7,8,9,10, donc l’augmentation de la masse mitochondriale peut augmenter la viabilité métabolique. L’augmentation de la masse mitochondriale dans les cellules irradiées pourrait être obtenue pour deux raisons : premièrement, les rayonnements ionisants induisent un blocage de la phase G2/M22,23 ; les cellules arrêtées en phase G2 auront un nombre plus élevé de mitochondries22,23,24 qui peuvent réduire davantage de MTT en formazan dans les cellules irradiées. Deuxièmement, les rayonnements ionisants sont connus pour induire la biogenèse mitochondriale20,21, ce qui entraîne une augmentation de la masse mitochondriale. Pour vérifier si l’arrêt G2/M induit par les radiations ou la biogenèse mitochondriale ou les deux sont responsables de l’augmentation de la masse mitochondriale par cellule dans les cellules irradiées, nous avons examiné les deux hypothèses séquentiellement. Puisque l’augmentation de la masse mitochondriale induite par le rayonnement (Fig. 2Ai à Gi) a été observée dans toutes les lignées cellulaires, seules les cellules HeLa et MDA-MB-231 ont été sélectionnées au hasard pour comprendre les mécanismes sous-jacents à l’augmentation de la viabilité métabolique induite par le rayonnement.

La distribution du cycle cellulaire a été effectuée à 24 et 48 heures après le rayonnement. A 24 heures, 17 et 6% de populations cellulaires excédentaires ont été trouvées dans la fraction G2/M du cycle cellulaire dans les cellules HeLa et MDA-MB-231 respectivement. Cependant, le blocage est complètement levé à 48 heures (Fig. 3A), ce qui suggère que l’arrêt du cycle cellulaire induit par le rayonnement peut contribuer en partie à l’augmentation de la masse mitochondriale à 24 heures mais pas à 48 heures. Il est également important de noter que l’augmentation de près de 17 % du nombre de cellules en phase G2/M ne peut pas entraîner une modification de 1,9 fois (soit 90 %) de la masse mitochondriale et de 1,5 fois de la réduction du MTT en formazan à 24 heures dans les cellules HeLa (Fig. 2Di et Dii). Bien que le blocage du cycle cellulaire ait été complètement supprimé après 48 heures, la masse mitochondriale et la viabilité métabolique améliorée sont restées significativement plus élevées que celles des témoins respectifs. Ces observations ne soutiennent pas la proposition selon laquelle l’amélioration de la viabilité métabolique induite par le rayonnement est due à l’arrêt du cycle cellulaire médié par une masse mitochondriale accrue, comme cela a été rapporté précédemment dans le cas du traitement par des composés polyphénoliques18,25.

En outre, pour tester l’hypothèse selon laquelle l’hyperactivité métabolique induite par les rayonnements, qui est corrélée à une masse mitochondriale accrue dans les cellules exposées (Fig. 2Ai à Gi), est due à la biogenèse mitochondriale induite par les rayonnements, nous avons analysé le nombre de copies d’ADNmt dans les cellules contrôlées et exposées aux rayonnements. Le nombre de copies du gène Leu t-RNA a été mesuré pour le nombre de copies d’ADNmt codé par le génome mitochondrial et normalisé par rapport au pol-gamma nucléaire, en utilisant la méthode de PCR semi-quantitative. Les cellules HeLa et MDA-MB-231 ont montré une augmentation de 18% et 31% du nombre de copies d’ADNmt après 24 heures d’exposition aux rayonnements, qui augmente encore jusqu’à 138% dans HeLa et reste 21% plus élevé dans MDA-MB-231 que les cellules témoins à 48 heures (Fig. 3B). De plus, nous avons examiné le niveau d’expression dépendant du temps des protéines PGC-1α (coactivateur 1-alpha du récepteur gamma activé par les proliférateurs de peroxysomes) et TFAM (facteur de transcription mitochondrial A) en utilisant le Western blot. Ces deux protéines sont les principaux régulateurs de la biogenèse et de la maintenance des mitochondries dans les cellules26,27,28. Il est intéressant de noter qu’une augmentation de l’expression de PGC-1α et de TFAM en fonction du temps (Fig. 3C) a été observée dans les cellules (HeLa et MDA-MB-231) exposées aux rayonnements, ce qui correspond à une augmentation de la masse mitochondriale au bout de 24 heures (Fig. 2Di et Gi). Nous avons ensuite vérifié si l’augmentation de la masse mitochondriale était fonctionnelle et si elle entraînait une augmentation de l’expression de la protéine SDH-A, qui est la principale enzyme réductrice du MTT en formazan7,8,9,10. Les niveaux de protéine SDH-A ont également été trouvés augmentés après 8 et 24 heures d’exposition aux radiations (Fig. 3C), ce qui est en corrélation avec l’augmentation de l’indice MTT ou l’augmentation de la viabilité métabolique des cellules HeLa et MDA-MB-231 (Figs 1 et 2). Les niveaux de SDH-A ont été trouvés significativement augmentés dans d’autres lignées cellulaires également (données non montrées). Pour valider l’hypothèse selon laquelle la biogénèse mitochondriale induite par les rayonnements entraîne une augmentation de la viabilité métabolique, nous avons inhibé la biogénèse mitochondriale en utilisant le chloramphénicol29,30. Nous avons constaté que le chloramphénicol, à une concentration non toxique, réduisait de manière significative la biogénèse mitochondriale induite par les rayonnements, dans les deux lignées cellulaires (Fig. 3D). Lorsque le MTT et la cinétique de croissance (Fig. 3E et F) ont été réalisés dans les cellules traitées avec du chloramphénicol avant l’exposition aux rayonnements, la formation de formazan a été significativement plus faible que pour les rayonnements seuls (Fig. 3E), ce qui suggère que la viabilité métabolique accrue induite par les rayonnements est principalement due à la biogénèse mitochondriale. La différence entre la courbe d’inhibition de la croissance induite par les rayonnements obtenue par le test MTT et le comptage cellulaire n’est que de 8 % dans les cellules traitées par le chloramphénicol (Fig. 3E et F), alors qu’elle était de 25 % et 33 % dans les cellules HeLa et MDA-MB-231 (Fig. 1Di-ii et Gi-ii), respectivement. Ces résultats corroborent l’hypothèse selon laquelle l’augmentation de la masse mitochondriale et de la viabilité métabolique induite par le rayonnement provient de la biogenèse mitochondriale induite par le rayonnement dans une large mesure, qui est régulée par PGC-1α et TFAM induits par le rayonnement.

Les radiations induisent une hyperactivation des mitochondries

Dans les résultats précédents, nous avons observé que les radiations ionisantes induisent la masse mitochondriale dans les cellules, ce qui semble être responsable de l’amélioration de la viabilité métabolique (indice MTT) dans les cellules irradiées ; cependant, il est connu que les radiations induisent également une hyperactivation des mitochondries individuelles dans les cellules irradiées31. Pour déterminer si l’augmentation de l’indice MTT est due à l’augmentation de la masse mitochondriale uniquement ou à l’hyperactivation des mitochondries induite par le rayonnement, nous avons mesuré le ΔΨm (potentiel de la membrane mitochondriale, PMM) par microscopie à fluorescence en utilisant le TMRM. Les cellules irradiées (à 24 heures) ont montré des mitochondries ponctuées rouge vif suggérant un ΔΨm élevé, par rapport au contrôle (Fig. 4A). Ce résultat a été validé par l’estimation quantitative de ΔΨm en utilisant DiOC6 par cytométrie de flux. Les cellules HeLa ont montré une augmentation de la MMP de 2,4 à 2,8 fois, tandis que les cellules MDA-MB-231 ont montré des changements de 1,3 fois dans la MMP induite par les radiations aux deux points de temps, respectivement (Fig. 4B). Ce potentiel membranaire mitochondrial élevé est en corrélation avec la formation de plusieurs fois le formazan dans chaque mitochondrie des cellules irradiées (image en médaillon dans la Fig. 2Aiii), suggérant une hyper activité du complexe II (SDH) (Fig. 2Aii à Gii), probablement due à l’augmentation de la ΔΨm induite par les radiations. Cette observation est conforme aux résultats antérieurs d’autres études, qui suggèrent que le complexe II est plus efficace pour établir et maintenir le ΔΨm dans des conditions de stress32,33. L’augmentation du ΔΨm due à l’hyperactivité du complexe II assure une activité accrue d’autres déshydrogénases mitochondriales également, qui peuvent contribuer à l’augmentation de la formation de formazan autres que SDH.

L’oxydation pilotée par le succinate via le complexe-II (SDH) a été trouvée avec la contribution significative vers la génération accrue de ROS mitochondriaux34. Par conséquent, nous avons analysé le niveau de superoxyde mitochondrial dans les cellules contrôlées et irradiées pour tester le fait que les mitochondries hyper métaboliquement actives devraient produire plus de radicaux superoxyde. Les cellules colorées avec MitoSox (indicateur de ROS mitochondrial) ont été analysées au cytomètre en flux. Les cellules irradiées montrent une fluorescence MitoSox significativement plus élevée que leur contrôle respectif. Les deux lignées cellulaires ont montré une augmentation de près de 1,25 fois des ROS mitochondriaux à 24 heures, mais cette augmentation est passée à 1,65 fois dans les cellules HeLa et à 1,5 fois dans les cellules MDA-MB-231 à 48 heures après l’exposition au rayonnement (Fig. 4C). La déshydrogénase mitochondriale SDH étant le principal facteur de réduction du MTT7,8,9,10, ces résultats confirment l’observation selon laquelle l’augmentation des ROS est directement proportionnelle à l’augmentation de l’activité SDH34. Ces résultats suggèrent que la masse mitochondriale accrue est constituée de mitochondries fonctionnellement hyperactives, réduisant une plus grande quantité de MTT en formazan par cellule dans les échantillons irradiés.

Les rayonnements induisent une accumulation de calcium dans les mitochondries

Les rayonnements ionisants perturbent l’homéostasie calcique cellulaire conduisant à une libération accrue de calcium du réticulum endoplasmique (RE) vers le cytoplasme, qui est ensuite tamponné par les mitochondries fonctionnelles dans la région périnucléaire des cellules35,36. L’altération de l’homéostasie calcique induit également la production de ROS (espèces réactives de l’oxygène) et la biogenèse mitochondriale35,36,37.

Pour étudier, si l’augmentation de la viabilité métabolique observée à 24 et 48 heures est due à l’augmentation des niveaux de Ca2+ cytoplasmiques et mitochondriaux, le Ca2+ libre cellulaire et mitochondrial a été estimé. Les cellules témoins et traitées ont été colorées avec du Fluo-3AM (indicateur de Ca2+) et du Rhod-2AM (indicateur spécifique de Ca2+ mitochondrial)38 aux points de temps respectifs et analysées au cytomètre en flux. L’augmentation significative du niveau de calcium a été observée dans les cellules irradiées, qui a été augmenté de près de 1,4 fois (40 %) dans les deux lignées cellulaires (HeLa et MDA-MB-231) étudiées, comme le suggère l’augmentation de la fluorescence du Fluo-3 à 8 heures, qui diminue marginalement à 24 heures (Fig. 5A). Il est intéressant de noter que l’augmentation du Ca2+ mitochondrial induite par le rayonnement est encore plus importante (2,4 fois pour HeLa et 1,6 fois pour MDA-MB-231, Fig. 5B). Cette observation a été vérifiée en visualisant les cellules colorées au microscope à fluorescence. On a observé les cellules colorées avec le rouge Mitotracker, le Fluo-3AM et le Rhod-2AM indépendamment 24 heures après l’irradiation. Le Fluo-3AM et le Rhod-2AM montrent tous deux une forte fluorescence ponctuée périnucléaire avec le même schéma que celui montré par le rouge mitotracker dans les cellules correspondantes exposées aux radiations (Fig. 5C), ce qui suggère que le Ca2+ cytoplasmique accru est accumulé dans les mitochondries. De plus, les signaux spécifiques de Ca2+ provenant des mitochondries dans les cellules colorées au Rhod-2AM valident cette observation. Il est intéressant de noter que les cellules MDA-MB-231 présentaient déjà un taux élevé de Ca2+ mitochondrial (coloration Rhod-2-AM) et un regroupement mitochondrial périnucléaire (coloration Mitotracker Red) dans les cellules témoins, qui augmente encore après l’irradiation, ce qui pourrait être la raison pour laquelle cette cellule présente la plus faible augmentation de la biogénèse mitochondriale et de la formation de formazan induites par les rayonnements, par la suite. Nous avons démontré dans notre étude précédente que le rayonnement provoque l’accumulation de Ca2+ dans les mitochondries, ce qui entraîne des dommages mitochondriaux et la mitophagie36. Les mitochondries avec un taux élevé de Ca2+ et un potentiel de membrane mitochondriale accru accumulent plus d’A23187 et montrent une fluorescence plus brillante au microscope sous excitation UV. Cependant, les mitochondries endommagées de façon permanente montrent une fluorescence très élevée et apparaissent comme des corps ronds à l’intérieur de la cellule36. Afin d’observer l’accumulation de Ca2+ dans les mitochondries dans ces conditions expérimentales, nous avons coloré les cellules HeLa et MDA-MB-231 contrôlées et irradiées 24 heures après l’exposition (Fig. 5C). Les cellules irradiées ont également montré une accumulation plus importante de corps indiquant que les mitochondries ont été endommagées par les radiations. Les cellules irradiées présentent une fluorescence plus élevée de Mitotracker Red, Fluo-3AM et Rhod-2AM dans la région périnucléaire (Fig. 5C), où la mitochondrie forme un réseau avec le réticulum endoplasmique (RE) et accumule la plupart des fuites de Ca2+ induites par le stress du RE et protège les cellules de la mort39. Cette découverte suggère que le Ca2+ libéré des réserves après une exposition aux rayonnements est principalement accumulé dans les mitochondries. Il a été signalé précédemment qu’un taux élevé de Ca2+ dans la matrice mitochondriale augmente l’activité de SDH40. Par conséquent, nous corrélons que le Ca2+ accumulé dans les mitochondries a augmenté l’activité du complexe SDH conduisant à des mitochondries hyperactives et à une viabilité métabolique accrue dans les cellules exposées aux radiations.

L’accumulation de calcium dans les mitochondries conduit à un état métabolique cellulaire hyperactif

En outre, pour étayer le rôle du Ca2+ dans la formation accrue de formazan, nous avons testé si la perturbation du Ca2+ dans les cellules peut à elle seule augmenter la viabilité métabolique. Pour tester cette proposition, les cellules ont été traitées avec l’ionophore Ca2+ A23187 (2 µM, qui augmente le Ca2+ cytoplasmique, comme les radiations ionisantes) pendant 1 heure et la viabilité métabolique a été analysée 4, 8 et 24 heures après le traitement. Il est intéressant de noter que les cellules traitées avec l’A23187 ont montré une augmentation significative (1,6 fois) de la viabilité métabolique par cellule 8 & 24 heures pour HeLa et 4 & 8 heures pour MDA-MB-231 (Fig. 6A), après le traitement. Ces résultats suggèrent que l’augmentation du Ca2+ cytoplasmique augmente la viabilité métabolique, en augmentant l’accumulation de Ca2+ dans les mitochondries (Fig. 5C). Nous avons également vérifié si l’inhibition de l’accumulation de Ca2+ dans les mitochondries pouvait entraver l’augmentation de la masse mitochondriale induite par les radiations. De manière intéressante, nous avons constaté que les cellules traitées avec l’inhibiteur de l’uniporteur de Ca2+ mitochondrial, le rouge de ruthénium (RuR, qui inhibe l’accumulation de Ca2+ dans les mitochondries) présentaient une augmentation significativement faible du contenu mitochondrial (induit par le rayonnement) par rapport au rayonnement seul (Fig. 6B). Il est connu que l’augmentation du Ca2+ induit la biogenèse mitochondriale par l’intermédiaire de CaMKII (Calmodulin Kinase-II)37,41, qui est également une protéine résidente mitochondriale connue pour réguler l’expression de PGC-1α37,41,42. Nous concluons donc que l’inhibition de l’accumulation de Ca2+ dans les mitochondries à l’aide du rouge de ruthénium a réduit la masse mitochondriale, probablement en inhibant la biogenèse mitochondriale. De plus, pour valider si l’augmentation du Ca2+ cytoplasmique induite par les radiations et son accumulation dans les mitochondries conduisent à une augmentation de la viabilité métabolique des cellules irradiées, nous avons traité les cellules avec du BAPTA-AM (un chélateur de calcium intracellulaire) et du RuR, 30 minutes avant l’irradiation. La chélation de l’augmentation du Ca2+ cytoplasmique à l’aide de BAPTA-AM (Fig. 6C) et l’inhibition de l’accumulation de Ca2+ dans les mitochondries à l’aide de RuR (Fig. 6D) ont toutes deux aboli l’augmentation de la viabilité métabolique induite par le rayonnement après 24 et 48 heures d’irradiation dans les cellules HeLa et MDA-MB-231 (Fig. 6C et D). Ces résultats suggèrent que la perturbation de l’homéostasie du Ca2+ induite par le rayonnement joue également un rôle important dans l’hyperactivation des mitochondries et l’augmentation de la viabilité métabolique, probablement en amont de la biogenèse mitochondriale.

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