Van ‘t Hoff a acquis sa première réputation dans le domaine de la chimie organique. En 1874, il a expliqué le phénomène de l’activité optique en supposant que les liaisons chimiques entre les atomes de carbone et leurs voisins étaient dirigées vers les coins d’un tétraèdre régulier. Cette structure tridimensionnelle explique les isomères que l’on trouve dans la nature. Il en partage le mérite avec le chimiste français Joseph Le Bel, qui a eu la même idée de manière indépendante.
Trois mois avant la remise de son doctorat, Van ‘t Hoff a publié cette théorie, qui est aujourd’hui considérée comme le fondement de la stéréochimie, d’abord dans un pamphlet néerlandais à l’automne 1874, puis au mois de mai suivant dans un petit livre français intitulé La chimie dans l’espace. Une traduction allemande parut en 1877, à une époque où le seul emploi que Van ‘t Hoff pouvait trouver était à l’école vétérinaire d’Utrecht. Au cours de ces premières années, sa théorie a été largement ignorée par la communauté scientifique, et a été vivement critiquée par un chimiste de premier plan, Hermann Kolbe. Kolbe a écrit:
« A Dr. J. H. van ‘t Hoff de l’école vétérinaire d’Utrecht n’a pas de goût, apparemment, pour l’investigation chimique exacte. Il a jugé plus commode de monter sur Pégase (apparemment emprunté à l’École vétérinaire) et de proclamer dans ‘La chimie dans l’espace’ comment, dans son vol audacieux au sommet du Parnasse chimique, les atomes lui ont paru disposés dans l’espace cosmique. »
Cependant, vers 1880, le soutien à la théorie de Van ‘t Hoff par des chimistes aussi importants que Johannes Wislicenus et Viktor Meyer a apporté la reconnaissance.
En 1884, Van ‘t Hoff publie ses recherches sur la cinétique chimique, intitulées Études de Dynamique chimique, dans lesquelles il décrit une nouvelle méthode pour déterminer l’ordre d’une réaction à l’aide de graphiques et applique les lois de la thermodynamique aux équilibres chimiques. Il a également introduit le concept moderne d’affinité chimique. En 1886, il montre une similitude entre le comportement des solutions diluées et celui des gaz. En 1887, il fonde avec le chimiste allemand Wilhelm Ostwald un magazine scientifique influent, le Zeitschrift für physikalische Chemie (« Journal de chimie physique »). Il travaille sur la théorie de la dissociation des électrolytes de Svante Arrhenius et, en 1889, fournit une justification physique de l’équation d’Arrhenius. En 1896, il devient professeur à l’Académie des sciences de Prusse à Berlin. Ses études sur les dépôts de sel à Stassfurt ont constitué une contribution importante à l’industrie chimique prussienne.
Van ‘t Hoff devient chargé de cours en chimie et en physique au Collège vétérinaire d’Utrecht. Il a ensuite travaillé comme professeur de chimie, de minéralogie et de géologie à l’université d’Amsterdam pendant près de 18 ans avant de devenir finalement le président du département de chimie. En 1896, Van ‘t Hoff s’installe en Allemagne, où il termine sa carrière à l’université de Berlin en 1911. En 1901, il reçoit le premier prix Nobel de chimie pour ses travaux sur les solutions. Ses travaux ont montré que les solutions très diluées suivent des lois mathématiques qui ressemblent beaucoup aux lois décrivant le comportement des gaz.