00:00:07.25Hi mon nom est Jennifer Doudna de l’UC Berkeley
00:00:09.26et je suis ici aujourd’hui pour vous raconter comment nous avons découvert
00:00:12.26une nouvelle technologie d’ingénierie du génome.
00:00:15.07Cette histoire commence par un système immunitaire bactérien
00:00:20.12c’est-à-dire comprendre comment les bactéries
00:00:22.14combattent une infection virale.
00:00:24.26Il s’avère que beaucoup de bactéries
00:00:28.04ont dans leur chromosome,
00:00:30.09ce qui est ce que vous regardez ici
00:00:32.15une séquence de répétitions montrée dans ces diamants noirs
00:00:36.18qui sont entrecoupées de séquences
00:00:40.19e qui sont dérivées de virus
00:00:43.08 et qui ont été remarquées par les microbiologistes
00:00:46.20qui séquençaient les génomes bactériens mais personne ne savait
00:00:50.10 quelle pouvait être la fonction de ces séquences
00:00:53.06jusqu’à ce qu’on remarque qu’elles ont tendance à se produire aussi
00:00:58.09 avec une série de gènes qui codent souvent des protéines
00:01:03.29 qui ont une homologie avec des enzymes qui font des choses intéressantes
00:01:09.03comme la réparation de l’ADN.
00:01:10.12C’était donc une hypothèse que ce système
00:01:14.04qui a été appelé CRISPR
00:01:16.08qui est un acronyme pour ce type de locus répétitif
00:01:19.14que ces systèmes CRISPR pourraient en fait être
00:01:22.29un système immunitaire acquis chez les bactéries
00:01:26.00qui pourrait permettre d’intégrer des séquences
00:01:29.06de virus et les utiliser plus tard
00:01:32.07pour protéger la cellule d’une infection
00:01:35.C’était donc une hypothèse intéressante
00:01:39.11 et nous avons commencé à l’étudier
00:01:41.18 au milieu des années 2000, juste après la publication
00:01:44.15de trois articles qui soulignaient
00:01:47.13l’incorporation de séquences virales
00:01:50.00dans ces loci génomiques.
00:01:52.07Et ce qui a émergé au cours des années suivantes
00:01:55.17est qu’en fait ces systèmes CRISPR
00:01:58.08sont en fait des systèmes immunitaires acquis chez les bactéries
00:02:01.18Alors, jusqu’à ce point, personne ne savait que les bactéries
00:02:04.24pouvaient avoir un moyen de s’adapter
00:02:08.08aux virus qui entrent dans la cellule
00:02:10.29mais c’est une façon de le faire
00:02:12.14et cela implique la détection d’ADN étranger
00:02:15.17qui est injecté comme montré dans cet exemple
00:02:18.04par un virus qui entre dans la cellule
00:02:20.07le système CRISPR permet l’intégration
00:02:26.06de courts morceaux de ces molécules d’ADN viral
00:02:29.15dans le locus CRISPR
00:02:31.07et ensuite dans la deuxième étape
00:02:33.27qui est montrée ici comme la biogénèse de l’ARN CRISPR
00:02:38.Ces séquences CRISPR sont en fait transcrites
00:02:42.20 dans la cellule en morceaux d’ARN
00:02:45.15 qui sont ensuite utilisés ensemble
00:02:48.23 avec les protéines codées par les gènes CAS
00:02:52.09ces gènes associés à CRISPR
00:02:54.01pour former des complexes interférents ou d’interférence
00:02:58.12qui peuvent utiliser l’information sous la forme
00:03:01.17de ces molécules d’ARN pour s’apparier par base
00:03:04.08avec des séquences correspondantes dans l’ADN viral.
00:03:07.18C’est donc un moyen très astucieux que les bactéries
00:03:10.12ont trouvé pour prendre leurs envahisseurs
00:03:13.06et retourner les informations de séquence contre eux.
00:03:17.00Donc dans mon propre laboratoire
00:03:20.21 nous sommes très intéressés depuis longtemps
00:03:23.09 à comprendre comment les molécules d’ARN
00:03:26.03 sont utilisées pour aider les cellules à comprendre
00:03:32.00 comment réguler l’expression des protéines
00:03:34.03du génome.
00:03:35.05Et donc cela semblait aussi un exemple très intéressant
00:03:37.27de ceci et
00:03:39.18nous avons commencé à étudier les mécanismes moléculaires de base
00:03:42.24par lesquels cette voie fonctionne.
00:03:45.01Et en 2011, je suis allé à une conférence scientifique
00:03:49.23et j’ai rencontré une de mes collègues,
00:03:52.13Emmanuelle Charpentier qui est représentée sur cette photo
00:03:56.10à l’extrême gauche et le laboratoire d’Emmanuelle
00:03:58.14 travaille sur des problèmes de microbiologie et ils sont
00:04:02.11particulièrement intéressés par les bactéries
00:04:04.00qui sont des pathogènes humains.
00:04:06.01Elle étudiait un organisme appelé
00:04:08.03Streptococcus pyogenes qui est une bactérie
00:04:11.15qui peut causer des infections très sévères chez les humains
00:04:14.25et ce qui était curieux dans ce microbe était qu’il
00:04:16.25a un système CRISPR et dans cet organisme
00:04:19.06il y avait un seul gène codant pour une protéine
00:04:21.27 connue sous le nom de Cas9
00:04:23.12qui s’était avérée génétiquement nécessaire
00:04:26.09pour le fonctionnement du système CRISPR
00:04:28.16dans Streptococcus pyogenes,
00:04:30.23mais personne ne savait à l’époque quelle était la fonction
00:04:33.05de cette protéine.
00:04:34.20Et donc nous nous sommes réunis et avons recruté
00:04:37.20des personnes de nos laboratoires de recherche respectifs
00:04:40.26pour commencer à tester la fonction de Cas9.
00:04:43.17Les personnes clés du projet
00:04:45.20sont montrées ici sur la photo
00:04:48.00au centre se trouve Martin Jinek
00:04:50.03qui est un associé postdoctoral dans mon propre laboratoire
00:04:52.17et à côté de lui dans la chemise bleue
00:04:54.22 c’est Kryztof Chylinski qui était étudiant
00:04:57.20 dans le laboratoire d’Emmanuelle
00:04:58.26et donc ces deux gars ensemble avec
00:05:00.21Ines Fonfara qui est à l’extrême droite,
00:05:02.10un postdoc avec Emmanuelle
00:05:04.01ont commencé à faire des expériences à travers l’Atlantique
00:05:07.25et à partager leurs données.
00:05:10.09Et ce qu’ils ont découvert, c’est que
00:05:13.06Cas9 est en fait une protéine fascinante
00:05:16.04qui a la capacité d’interagir avec l’ADN
00:05:19.28 et de générer une cassure double brin
00:05:22.02 dans l’ADN à des séquences qui correspondent
00:05:25.06à la séquence dans un ARN guide
00:05:27.08et ce que vous voyez sur cette diapositive
00:05:29.06est que l’ARN guide
00:05:30.10et la séquence du guide en orange
00:05:32.11s’apparie avec un brin
00:05:34.18de l’ADN double hélice
00:05:37.11et très important, cet ARN
00:05:39.28interagit avec une seconde molécule d’ARN
00:05:42.09appelée tracr qui forme une structure
00:05:46.03qui recrute la protéine Cas9
00:05:47.29donc ces deux ARN et une seule protéine
00:05:50.13 dans la nature sont ce qui est nécessaire
00:05:52.23pour que cette protéine reconnaisse
00:05:56.05ce qui serait normalement des ADN viraux
00:05:58.11dans la cellule et la protéine
00:06:01.13est capable de les couper,
00:06:02.14littéralement en cassant l’ADN à double hélice.
00:06:05.24Et donc, quand nous avons compris cela
00:06:08.14nous avons pensé : ne serait-il pas étonnant
00:06:10.26si nous pouvions en fait générer un système plus simple
00:06:13.29Comme la nature l’a fait
00:06:15.02en reliant ensemble ces deux molécules d’ARN
00:06:18.04pour générer un système qui serait une seule protéine
00:06:20.16et un seul ARN directeur.
00:06:22.28Donc, l’idée était de prendre essentiellement
00:06:25.17ces deux ARN que vous voyez de l’autre côté
00:06:29.29de la diapositive et ensuite de les lier ensemble
00:06:33.19pour créer ce que nous appelons
00:06:35.04un ARN guide unique.
00:06:36.22Alors Martin Jinek dans le laboratoire
00:06:38.25a fabriqué cette construction
00:06:40.21et nous avons fait une expérience très simple
00:06:44.22pour tester si nous avions vraiment
00:06:46.18une enzyme de clivage d’ADN programmable
00:06:49.29et l’idée était de générer des ARN guides courts et uniques
00:06:54.04qui reconnaissent différents sites dans une molécule d’ADN circulaire
00:06:59.24que vous voyez ici
00:07:00.21et les ARN guides ont été conçus
00:07:03.10pour reconnaître les séquences montrées par les barres rouges
00:07:06.17 dans la diapositive et l’expérience a ensuite été
00:07:10.16de prendre ce plasmide, cette molécule d’ADN circulaire
00:07:13.21et de l’incuber avec deux enzymes de restriction (ou de coupe) différentes,
00:07:18.27une appelée SalI qui coupe
00:07:21.23 l’ADN en amont à l’extrémité
00:07:25.05 de l’ADN sur cette image
00:07:26.12 dans la boîte grise,
00:07:27.19et le second site étant dirigé
00:07:31.00par le Cas9 guidé par l’ARN
00:07:33.13à ces différents sites indiqués en rouge.
00:07:35.16Et une expérience très simple
00:07:37.19nous avons fait cette réaction d’incubation
00:07:39.26avec de l’ADN plasmidique et voici le résultat
00:07:43.24et donc ce que vous regardez
00:07:45.28est un gel d’agarose
00:07:47.29qui nous permet de séparer
00:07:49.16les molécules d’ADN clivées
00:07:51.20et ce que vous pouvez voir, c’est que dans chacune de ces voies de réaction
00:07:54.22nous obtenons une molécule d’ADN de taille différente libérée
00:07:58.12de ce plasmide doublement digéré
00:08:00.16dans lequel la taille de l’ADN
00:08:03.29correspond au clivage aux différents sites
00:08:06.11dirigés par ces séquences d’ARN guide
00:08:08.26indiquées en rouge
00:08:10.24c’était donc un moment vraiment excitant
00:08:12.29en fait une expérience très simple qui était
00:08:15.15une sorte de moment « A ha ! »
00:08:17.03quand nous avons dit que nous avons vraiment une enzyme programmable pour couper l’ADN
00:08:22.02 et que nous pouvons la programmer avec un court morceau d’ARN
00:08:24.15pour couper essentiellement n’importe quelle séquence d’ADN double brin
00:08:28.07La raison pour laquelle nous étions si excités
00:08:30.23par une enzyme qui peut être programmée
00:08:33.19pour générer des cassures d’ADN double brin
00:08:36.01à n’importe quelle séquence est parce que
00:08:39.00il y avait un ensemble d’expériences de longue date
00:08:42.16 dans la communauté scientifique qui a montré
00:08:45.13 que les cellules ont des moyens de réparer les cassures d’ADN double brin
00:08:49.26 qui conduisent à des changements
00:08:52.02dans l’information génomique de l’ADN
00:08:55.21c’est donc une diapositive qui montre que
00:08:58.20après qu’une cassure double brin soit générée
00:09:01.14par n’importe quel type d’enzyme qui pourrait le faire
00:09:04.13y compris le système Cas9
00:09:06.05ces cassures double brin dans une cellule
00:09:09.07sont détectées et réparées par deux types de voies
00:09:13.15une à gauche qui implique
00:09:17.26la jonction des extrémités non homologues
00:09:20.07dans lequel les extrémités de l’ADN sont chimiquement ligaturées
00:09:24.07 ensemble, généralement avec l’introduction
00:09:26.18d’une petite insertion ou délétion
00:09:28.25au site de la cassure
00:09:29.27et sur le côté droit
00:09:32.01 une autre façon dont la réparation se produit
00:09:34.00 par la réparation dirigée par homologie
00:09:37.22dans laquelle une molécule d’ADN donneur
00:09:39.14a des séquences qui correspondent à celles
00:09:43.28flanquant le site de la rupture
00:09:45.12 double brin peut être intégrée
00:09:48.05dans le génome au site
00:09:50.10de la rupture pour introduire une nouvelle information génétique
00:09:54.06dans le génome
00:09:55.15 Cela a donc donné à de nombreux scientifiques
00:09:59.04 l’idée que s’il existait un outil
00:10:01.04ou une technologie permettant
00:10:03.05aux scientifiques ou aux chercheurs d’introduire
00:10:06.12des cassures double brin à des sites ciblés
00:10:09.00dans l’ADN d’une cellule, alors, ensemble
00:10:12.12avec toutes les données de séquençage du génome
00:10:14.21qui sont maintenant disponibles, nous connaissons la
00:10:16.10séquence génétique complète d’une cellule
00:10:18.21et si vous savez où s’est produite une mutation
00:10:21.20qui cause une maladie par exemple
00:10:23.20vous pourriez en fait utiliser une technologie comme celle-ci
00:10:26.25pour introduire de l’ADN qui corrigerait une mutation
00:10:31.00ou générer une mutation
00:10:32.23 que vous aimeriez étudier dans un cadre de recherche
00:10:35.04 donc la puissance de cette technologie est
00:10:38.28réellement l’idée que nous pouvons maintenant générer
00:10:41.20 ces types de cassures double brin
00:10:43.17aux sites que nous choisissons en tant que scientifiques
00:10:46.17en programmant Cas9 et ensuite permettre
00:10:48.13à la cellule de faire des réparations qui introduisent
00:10:51.04des changements génomiques aux sites de ces ruptures
00:10:54.15mais le défi était de savoir comment générer les cassures
00:10:58.11en premier lieu et donc un certain nombre
00:11:00.09de stratégies différentes avaient été produites
00:11:03.24pour faire cela dans différents laboratoires
00:11:05.15 La plupart d’entre elles, et je vais montrer
00:11:08.21deux exemples spécifiques ici
00:11:10.17l’une appelée nucléase à doigt de zinc
00:11:12.25et l’autre domaine effecteur TAL
00:11:15.02sont toutes deux des moyens programmables
00:11:18.08pour générer des cassures double brin dans l’ADN
00:11:20.21qui s’appuieront sur la reconnaissance par les protéines
00:11:23.29des séquences d’ADN ; ce sont donc des protéines
00:11:26.06modulaires, qui peuvent être générées
00:11:29.12 dans différentes combinaisons de modules
00:11:31.22 pour reconnaître différentes séquences d’ADN
00:11:34.03 cela fonctionne comme une technologie
00:11:37.18mais cela nécessite beaucoup d’ingénierie des protéines
00:11:40.24pour le faire, et ce qui est vraiment excitant
00:11:43.16de cette enzyme CRISPR/Cas9
00:11:46.11est qu’il s’agit d’une protéine programmée par ARN
00:11:49.25donc une seule protéine peut être utilisée pour
00:11:52.09tout site de l’ADN où nous
00:11:54.27voulons générer une cassure
00:11:56.13en changeant simplement la séquence
00:11:58.16de l’ARN guide associé à Cas9
00:12:00.24ainsi, au lieu de compter sur la reconnaissance de l’ADN basée sur les protéines
00:12:03.06 nous comptons sur
00:12:06.04la reconnaissance de l’ADN basée sur l’ARN
00:12:08.26comme indiqué en bas, donc ce que cela signifie
00:12:11.03est que c’est juste un système
00:12:12.18qui est assez simple à utiliser
00:12:15.15pour que n’importe qui avec une formation de base en biologie moléculaire
00:12:19.05peut profiter de ce système
00:12:20.29pour faire de l’ingénierie génomique
00:12:22.20et donc c’est un outil qui vraiment
00:12:26.06je pense, remplit un composant essentiel
00:12:29.03et précédemment manquant
00:12:30.24de ce qu’on pourrait appeler la boîte à outils informatique de la biologie
00:12:33.29 qui inclut non seulement la capacité
00:12:36.00de séquencer l’ADN et de regarder
00:12:38.06sa structure, nous connaissons
00:12:39.24la double hélice depuis les années 1950
00:12:42.00et ensuite, au cours des dernières décennies
00:12:44.18 il a été possible d’utiliser des enzymes
00:12:46.09comme les enzymes de restriction
00:12:47.26et la réaction en chaîne par polymérase
00:12:49.09pour isoler et amplifier des segments particuliers
00:12:52.19d’ADN et maintenant avec Cas9
00:12:55.10 nous avons une technologie qui permet
00:12:57.15une ingénierie facile du génome
00:12:59.13qui est disponible pour les laboratoires du monde entier
00:13:03.07pour les expériences qu’ils pourraient vouloir faire
00:13:05.08et c’est donc un résumé de la technologie
00:13:10.11du système à 2 composants
00:13:11.29il s’appuie sur l’appariement des bases ARN-ADN
00:13:14.16pour la reconnaissance
00:13:15.21et très important en raison de la façon
00:13:18.24 que ce système fonctionne, il
00:13:19.28 est en fait assez simple
00:13:21.18 de faire quelque chose appelé multiplexage
00:13:24.20 ce qui signifie que nous pouvons programmer Cas9
00:13:27.00 avec plusieurs ARN guides différents
00:13:28.23dans la même cellule pour générer
00:13:30.19des cassures multiples et faire des choses
00:13:32.06comme couper de grands segments d’un chromosome
00:13:35.01et simplement les supprimer en une seule expérience.
00:13:38.25Et donc cela a conduit à une véritable explosion
00:13:42.03 dans le domaine de la biologie et de la génétique
00:13:45.19avec de nombreux laboratoires dans le monde
00:13:48.08adoptant cette technologie
00:13:49.25pour toutes sortes d’applications très intéressantes
00:13:51.15et créatives
00:13:53.13et ceci est une diapositive
00:13:54.24qui est en fait presque périmée maintenant
00:13:56.11mais juste pour vous donner une idée
00:13:57.14de la façon dont le domaine
00:14:00.07a vraiment décollé
00:14:01.08ainsi nous avons publié notre travail original sur Cas9
00:14:04.10en 2012 et jusqu’à ce moment-là
00:14:07.16il y avait très peu de recherche
00:14:08.18sur la biologie CRISPR
00:14:11.12c’était un très petit domaine
00:14:12.19et ensuite vous pouvez voir que
00:14:13.27en commençant en 2013 et en s’étendant
00:14:16.09jusqu’à maintenant, il y a eu cette
00:14:17.21incroyable explosion de publications
00:14:20.16de laboratoires qui utilisent
00:14:22.09cette technologie d’ingénierie des génomes
00:14:24.01. C’est donc très excitant pour moi
00:14:26.25 en tant que scientifique fondamental de voir ce qui a commencé
00:14:29.22 comme un projet de recherche fondamentale
00:14:31.12 se transformer en une technologie qui s’avère
00:14:34.08 très habilitante pour toutes sortes
00:14:35.28 d’expériences passionnantes
00:14:37.07 et je voulais juste terminer en partageant
00:14:40.07 avec vous quelques choses
00:14:42.17 qui se passent en utilisant cette technologie
00:14:44.17 alors bien sûr sur le côté gauche
00:14:47.13beaucoup de biologie fondamentale peut être faite maintenant
00:14:50.02avec l’ingénierie d’organismes modèles
00:14:53.03et différents types de lignées cellulaires
00:14:55.02qui sont cultivées en laboratoire
00:14:56.21pour étudier le comportement des cellules
00:14:58.13mais aussi en biotechnologie, être capable de
00:15:01.23faire des changements ciblés dans les plantes
00:15:05.15 et divers types de champignons qui pourraient être très
00:15:07.11 utiles pour différentes sortes d’applications industrielles
00:15:09.29et puis bien sûr en biomédecine
00:15:12.14avec beaucoup d’intérêt pour le potentiel
00:15:14.14d’utiliser cette technologie comme un outil
00:15:17.03pour vraiment trouver de nouvelles thérapies
00:15:21.06pour les maladies humaines, je pense que c’est quelque chose
00:15:23.09qui est très excitant et c’est vraiment quelque chose
00:15:26.05qui est déjà à l’horizon
00:15:27.09et puis cette diapositive indique vraiment
00:15:30.20où je pense que nous allons voir cela aller
00:15:33.15 dans le futur avec beaucoup de directions intéressantes
00:15:36.20et créatives
00:15:39.03qui se développent dans différents laboratoires
00:15:41.02à la fois dans les laboratoires de recherche académiques
00:15:43.19mais aussi de plus en plus dans les laboratoires commerciaux
00:15:45.29 qui vont permettre l’utilisation de cette
00:15:49.24technologie pour toutes sortes d’applications
00:15:52.18dont beaucoup n’auraient même pas pu
00:15:54.10être imaginées il y a deux ans.
00:15:56.05C’est donc très excitant et je veux juste reconnaître une grande équipe
00:16:01.10de personnes qui ont été impliquées dans le travail
00:16:04.22 sur le projet avec moi et nous avons
00:16:06.07 eu un soutien financier formidable de divers groupes
00:16:11.00 aussi et ce fut un plaisir
00:16:13.00 de partager cela avec vous, merci.