L’immunohistochimie (IHC) est une technique puissante basée sur la microscopie pour visualiser les composants cellulaires, par exemple les protéines ou autres macromolécules dans les échantillons de tissus. La force de l’IHC est le résultat visuel intuitif qui révèle l’existence et la localisation de la protéine cible dans le contexte de différents types de cellules, états biologiques, et/ou localisation subcellulaire dans des tissus complexes.
La technique IHC a été inventée au cours des années 1940 (Coons, Creech, & Jones, 1941) et est couramment utilisée comme un outil important dans les soins de santé et la pathologie, par exemple à des fins de diagnostic ou pour stratifier les patients pour des régimes de traitement optimisés. L’IHC est également largement utilisée dans la recherche où les molécules d’intérêt sont analysées pour étudier leurs rôles dans les cellules et les tissus sains et malades au niveau moléculaire, cellulaire ou tissulaire. Il existe de nombreuses façons de réaliser la visualisation des cibles dans les tissus à l’aide de l’IHC ou de méthodes basées sur l’IHC, et de nombreux protocoles existent pour différentes applications et analyses. Même si l’IHC est généralement une méthode robuste et bien établie, les nouveaux tests doivent souvent être soigneusement optimisés en fonction du tissu ou des propriétés de la protéine cible, de la molécule liante et/ou du système rapporteur. De nombreuses années de développement technique et l’augmentation considérable de la disponibilité de molécules de liaison spécifiques ont considérablement amélioré l’utilité et les domaines d’application de l’IHC. Les progrès réalisés dans le domaine des techniques et des réactifs basés sur l’IHC ont permis aux scientifiques et aux prestataires de soins de santé de disposer d’outils, de tests et de biomarqueurs plus précis. En outre, les progrès techniques ont permis, par exemple, la détection simultanée très sensible de plusieurs protéines dans le même échantillon, et la détection d’interactions protéine-protéine (voir le test de ligature de proximité).
Le test IHC classique est illustré dans la figure 1 et implique la détection d’épitopes exprimés par une seule protéine-cible dans un échantillon de tissu en utilisant un « anticorps primaire » capable de se lier à ces épitopes avec une grande spécificité. Après l’événement de liaison épitope-anticorps, un « anticorps secondaire » capable de se lier à l’anticorps primaire avec une grande spécificité est ajouté. L’anticorps secondaire est couplé à une molécule rapporteur et après l’événement de liaison anticorps-anticorps, on ajoute un substrat chimique qui réagit avec la molécule rapporteur pour produire un précipité coloré au site du complexe épitope-anticorps entier.
Figure 1. Le principe de base de l’immunohistochimie.
Dans l’illustration schématique (figure 1), une coupe de tissu fixée au formol et incluse en paraffine est colorée en utilisant un anticorps primaire dirigé vers une cible protéique spécifique. Une solution contenant l’anticorps primaire est ajoutée à la coupe de tissu et les anticorps ont un certain temps pour trouver et se lier à leur cible. Après cette étape, les anticorps non liés et excédentaires sont éliminés par lavage et l’anticorps secondaire est ajouté. L’anticorps secondaire, qui porte une molécule de liaison avec des enzymes de peroxydase de raifort (HRP), a également le temps de se lier à l’anticorps primaire, puis on procède à un autre lavage. Ensuite, la 3,3′ Diaminobenzidine (DAB) est ajoutée. L’enzyme HRP transforme le substrat DAB en un précipité brunâtre qui est déposé dans le tissu au site de la réaction, produisant ainsi une représentation visuelle de l’endroit où l’anticorps primaire a d’abord lié sa cible.
Technologie
Préparation du tissu
Le tissu joue un rôle central dans l’expérience et il est important qu’il soit traité de manière à ce que les épitopes et la morphologie appropriée soient préservés. Le traitement le plus courant pour l’IHC consiste à préparer des blocs de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE). Le but de la fixation au formol est de produire une réticulation chimique des protéines dans le tissu. Cela met fin à tous les processus cellulaires et fige les composants cellulaires à l’endroit et dans la conformation où ils se trouvaient au moment de la fixation et empêche également leur dégradation. Après une fixation adéquate, le tissu est traité et finalement inclus dans des blocs de paraffine, qui sont ensuite coupés en tranches fines (généralement 4-10µm) à l’aide d’un microtome. Les sections sont transférées sur des lames de verre et on les laisse adhérer avant de poursuivre le traitement.
D’autres méthodes de fixation que le formol sont parfois utilisées. Elles comprennent d’autres types d’aldéhydes ou l’utilisation de différentes solutions alcooliques. Le meilleur choix de fixateur dépend beaucoup de l’essai. Une alternative courante à la FFPE consiste à préparer des échantillons de tissus congelés. Dans ce cas, le tissu est enrobé dans un milieu cryoprotecteur et congelé, et la fixation est effectuée après la coupe. Les tissus congelés sont sectionnés dans des cryostats et présentent l’avantage d’un temps de traitement court et d’une meilleure préservation des épitopes sensibles, mais peuvent souvent être inférieurs aux tissus FFPE en termes de préservation de la morphologie histologique.
Récupération de l’antigène (épitope)
Une préoccupation associée aux fixateurs réticulants comme le formol, ou à un temps trop long passé dans le milieu fixateur est le masquage des épitopes, qui peut empêcher l’anticorps primaire de se lier à sa cible. En particulier avec les échantillons FFPE, il est souvent nécessaire d’inverser une partie de la réticulation chimique et de « récupérer » les épitopes avant de procéder à l’IHC proprement dite. Il existe plusieurs protocoles de récupération des antigènes et les principales stratégies consistent à traiter la lame de tissu avec de la chaleur, des enzymes digestives, des détergents ou des combinaisons de ceux-ci. La méthode la plus courante pour la récupération de l’antigène dans les échantillons FFPE consiste à faire bouillir sous pression les lames de tissu dans un tampon de citrate acide pendant environ 15 à 20 minutes.
La liaison des anticorps
La qualité et la spécificité de la molécule de liaison sont cruciales pour toute technique basée sur l’IHC, et le choix du liant peut directement affecter le résultat, la fiabilité et éventuellement aussi l’interprétation du test. Les anticorps sont de loin le type de molécule de liaison le plus communément utilisé pour l’IHC, et bien que la plupart des anticorps soient capables de détecter de manière adéquate la bonne molécule d’intérêt, ils peuvent également varier considérablement dans leur spécificité pour leur cible prévue. Les anticorps très spécifiques sont donc plus fiables pour l’interprétation de la liaison « sur la cible », car ils produisent peu ou pas de liaison « hors cible » ou de « bruit de fond ». Les anticorps moins spécifiques peuvent produire plus de liaison hors cible, et le bruit de fond qui en résulte peut interférer avec l’interprétation correcte des véritables signaux sur cible. Il existe deux principaux types d’anticorps : les anticorps polyclonaux, qui sont un mélange hétérogène d’anticorps se liant à différents épitopes sur la cible, et les anticorps monoclonaux, qui se lient tous au même épitope. Les anticorps polyclonaux sont souvent très puissants en raison de leur capacité à détecter et à lier plusieurs épitopes sur la même cible. Cependant, les épitopes qu’ils lient sont souvent mal définis et les spécificités multiples et variables des épitopes s’accompagnent d’une probabilité accrue d’événements de liaison hors cible et de bruit de fond. Cependant, la puissance des anticorps polyclonaux peut être avantageuse car la concentration d’événements de liaison autour de la molécule ciblée l’emporte généralement sur le bruit de fond potentiel. Un inconvénient est que les anticorps polyclonaux sont généralement des ressources limitées puisqu’ils sont dérivés de sérums animaux. Les anticorps monoclonaux, en revanche, ont plus de continuité puisqu’ils peuvent être produits dans des lignées cellulaires d’hybridomes. Les anticorps monoclonaux sont également souvent bien définis en termes de liaison d’épitope, mais peuvent encore générer des résultats difficiles à interpréter si la spécificité est faible ou si l’épitope cible est présent en faible abondance.
Il est nécessaire d’optimiser et de titrer soigneusement la concentration d’anticorps pour chaque essai, car le résultat dépend non seulement de la spécificité et de l’affinité de l’anticorps pour la cible, mais aussi de la concentration et de la disponibilité des épitopes on-target et hors cible potentiels présents dans l’échantillon. L’ajout d’une trop grande quantité d’anticorps à l’échantillon augmentera le nombre d’événements possibles de liaison hors cible de faible affinité une fois que le ou les épitopes sur cible seront saturés de liants. En diminuant la concentration d’anticorps, les événements de liaison hors cible deviennent plus rares car ils ont généralement une affinité plus faible que les événements de liaison sur cible. Le risque lorsqu’on tente de réduire le bruit de fond tout en utilisant un anticorps de faible affinité est que les signaux sur cible sont concomitamment affaiblis au point de fournir un résultat faussement négatif.
Les autres types de molécules liantes parfois utilisées dans les techniques basées sur l’IHC comprennent les affibodies, les peptides, les fragments d’anticorps ou d’autres petites molécules.
Systèmes de détection
Tout l’objectif de la réalisation de l’IHC est d’obtenir une représentation visuelle de l’endroit où la cible peut être trouvée dans le tissu expérimental, et de préférence aussi d’obtenir des informations sur le modèle d’expression de la cible parmi des populations cellulaires hétérogènes et/ou des localisations subcellulaires. La figure 2 illustre comment différents anticorps sont utilisés pour visualiser différents compartiments cellulaires ou tissulaires dans un tissu complexe. Pour visualiser l’interaction entre la cible et l’anticorps, il faut un système de détection qui produise une coloration ou un signal observable. La méthode la plus courante pour introduire un système de détection dans l’expérience consiste à utiliser un anticorps secondaire qui porte une molécule rapporteur pré liée, c’est-à-dire une enzyme ou un fluorophore. Les anticorps secondaires sont généralement ciblés spécifiquement sur les molécules d’anticorps d’une autre espèce animale. Par exemple, si l’anticorps primaire est élevé chez un lapin, alors l’anticorps secondaire doit être élevé chez un autre animal et cibler spécifiquement les anticorps de lapin.
| Esophage | Magnification | ||
|---|---|---|---|
| Coloration à l’hématoxyline | Aucune coloration par anticorps | ||
| TP63 CAB000083 |
Coloration nucléaire | ||
| . EGFR CAB000035 |
Coloration membraneuse | ||
| G6PD HPA000247 |
Coloration cytoplasmique | ||
| LAMB2 (Laminine) CAB000053 |
Tissu conjonctif |
Figure 2. Visualisation de différentes cibles protéiques dans des tissus complexes. La colonne de droite montre un agrandissement des images correspondantes dans la colonne de gauche.
Dans l’image IHC (figure 2), des sections consécutives d’œsophage humain colorées à l’aide de quatre anticorps différents permettent de comparer directement les différents modèles d’expression des protéines dans le tissu et dans les compartiments subcellulaires. Les images supérieures sont contre-colorées à l’hématoxyline pour comparaison. L’anticorps p63 colore les noyaux cellulaires dans une population de cellules qui se trouvent dans la partie basale de l’épithélium de l’œsophage. L’anticorps EGFR (récepteur du facteur de croissance épidermique) semble colorer la même population de cellules que p63, mais il colore les membranes cellulaires au lieu des noyaux. L’anticorps G6PD (Glucose-6-phosphate déshydrogénase) colore le cytoplasme d’un répertoire plus large de cellules épithéliales de l’œsophage ainsi que les cellules résidant dans le tissu conjonctif. L’anticorps Laminin (LAMB2) ne colore que les cellules et les structures du tissu conjonctif sous-jacent à l’œsophage.
Pour les échantillons de tissus FFPE, la méthode de détection la plus courante consiste à utiliser des réactions enzymatiques pour générer un précipité coloré au site de liaison des anticorps. Les anticorps secondaires portent alors une enzyme, par exemple la peroxydase de raifort (HRP) ou la phosphatase alcaline (AP), qui sont capables de convertir des chromogènes comme la 3,3′ Diaminobenzidine (DAB) ou le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/chlorure de p-nitroblue tétrazolium (BCIP/NBT) en précipités bruns ou bleutés qui se déposent dans le tissu au site de la réaction. Les colorants chromogènes sont observables en microscopie optique et sont généralement très stables sur de longues périodes, ce qui est bénéfique si l’expérience doit être archivée ou revue à un moment ultérieur.
Pour les coupes de tissus congelés, il est plus courant d’utiliser des anticorps secondaires liés à des fluorophores qui émettent une couleur spécifique (généralement verte, rouge ou bleue) lorsqu’ils sont excités par les bonnes longueurs d’onde de la lumière. De plus, les fluorophores ne sont généralement pas stables sur de longues périodes. Cependant, l’avantage de l’utilisation des fluorophores est qu’ils fournissent une méthode facile pour réaliser des expériences de double marquage où plusieurs anticorps dirigés vers plusieurs cibles sont testés dans le même échantillon. Les anticorps secondaires doivent être dirigés vers différents anticorps primaires et être couplés à différents fluorophores. Les différents anticorps secondaires sont ensuite observés séparément en les excitant séquentiellement avec différentes longueurs d’onde de lumière. Ces différents résultats d’excitation sont enregistrés sous forme d’images séparées (ou canaux de couleur) et peuvent être superposés ultérieurement pour déduire les colocalisations de protéines, etc.
L’utilisation d’anticorps secondaires porteurs de rapporteurs pour la détection est en soi une étape d’amplification puisque plusieurs anticorps secondaires sont capables de se lier à un seul anticorps primaire, mais parfois d’autres étapes d’amplification sont souhaitées pour augmenter le signal et la sensibilité de l’expérience. Dans ce cas, l’anticorps secondaire peut porter des « molécules de liaison », par exemple des polymères de biotine, qui sont capables de recruter un plus grand nombre de molécules rapporteuses dans les étapes suivantes. Cette stratégie d’amplification des signaux est utile pour les méthodes de détection enzymatique et fluorescente.
Contre-coloration
La coloration immunohistochimique utilisant des chromogènes bénéficie souvent de l’application d’une contre-coloration qui renforce le contraste et facilite l’observation des caractéristiques histologiques. Le type de contre-coloration le plus communément utilisé pour les échantillons FFPE est l’hématoxyline qui colore le cytoplasme cellulaire d’une couleur bleuâtre pâle, et colore les noyaux cellulaires d’une nuance bleuâtre plus sombre. Les colorations fluorescentes ne sont généralement pas contre-colorées avec de l’hématoxyline, car la méthode de détection n’est pas basée sur la microscopie optique. Au lieu de cela, la façon la plus courante d’obtenir une contre-coloration pour la fluorescence est de marquer les noyaux cellulaires en ajoutant des colorants fluorescents qui se lient aux acides nucléiques. Après la réaction immunohistochimique proprement dite, les seules étapes restantes consistent à recouvrir et à sceller l’échantillon pour le protéger et le conserver à long terme. La méthode la plus courante consiste à « coller » le couvre-objet à l’échantillon à l’aide de résines spécialisées disponibles dans le commerce.
Exemples spécifiques
L’IHC est largement utilisée tant dans la recherche que dans la pratique clinique. Le projet Human Protein Atlas (HPA) est un excellent exemple de l’utilisation de l’IHC à haut débit pour réaliser une cartographie à grande échelle du protéome humain dans une multitude de tissus, de cancers et de cellules. Dans le cadre du projet HPA, une chaîne interne rationalisée de production d’anticorps à grande échelle facilite la génération d’anticorps spécifiques qui, après avoir passé les régimes de caractérisation et de validation de base, sont utilisés pour colorer systématiquement des microréseaux de tissus contenant des centaines de noyaux de tissus au cours d’une seule expérience. Le système d’IHC employé par l’HPA repose largement sur la normalisation des protocoles et l’automatisation à l’aide de machines, mais l’évaluation du titrage optimal pour chaque anticorps est effectuée manuellement avant que l’anticorps ne soit approuvé pour la coloration de l’ensemble des tissus. Chaque carotte de tissu coloré est annotée en ce qui concerne la coloration immunohistochimique des tissus et des types de cellules, et par la suite publiée en tant qu’image haute résolution sur le portail web pour être librement consultée par quiconque.
Dans la pratique clinique, l’IHC est principalement utilisée en pathologie pour aider les médecins à évaluer les spécimens de tissus par rapport aux états sains et ou malades, pour établir des diagnostics et pour définir le sous-type moléculaire de différents types de cancer. Un exemple spécifique d’utilisation de l’IHC à des fins diagnostiques est celui des pathologistes qui reçoivent un échantillon de tumeur métastatique et dont l’origine tissulaire de la tumeur primaire est inconnue. Dans ces cas, les pathologistes utilisent un panel de différents anticorps qui ciblent des protéines spécifiques aux tissus, comme l’antigène spécifique de la prostate pour le cancer de la prostate, ou le récepteur d’œstrogène pour les cancers gynécologiques, ou la cytokératine 20 pour les cancers gastro-intestinaux (Gremel et al., 2014). Une fois qu’une classification générale est effectuée, d’autres anticorps spécifiques aux tissus sont utilisés pour préciser davantage l’origine de la tumeur primaire. Ces informations sont utiles pour choisir la meilleure stratégie ou la plus appropriée pour la thérapie médicamenteuse et/ou pour localiser la tumeur primaire pour la radiothérapie et/ou la chirurgie.
Références et liens
Anticorps couramment utilisés pour le diagnostic du cancer:
Gremel G et al, Une analyse systématique des anticorps couramment utilisés dans le diagnostic du cancer. Histopathologie. (2014)
PubMed : 24330150 DOI : 10.1111/his.12255
Une revue sur la validation des anticorps pour IHC:
O’Hurley G et al., Garbage in, garbage out : une évaluation critique des stratégies utilisées pour la validation des biomarqueurs immunohistochimiques. Mol Oncol. (2014)
PubMed : 24725481 DOI : 10.1016/j.molonc.2014.03.008
Antibodypedia – Une base de données en accès libre d’anticorps disponibles publiquement et de leur utilité dans diverses applications:
Monde de l’IHC – Protocoles, Forum, Produits et plus encore:
Un clip YouTube illustrant l’IHC de BioGenexLaboratories:
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