Frontiers in Oncology

Introduction

On sait que l’infection persistante par le papillomavirus humain à haut risque (hr-HPV) est une cause nécessaire du cancer du col de l’utérus et des lésions précancéreuses (1, 2). Avec une étiologie révélée, le cancer du col de l’utérus est hautement évitable (3, 4). Les pays développés ont commencé à utiliser le test hr-HPV dans le dépistage primaire du cancer du col de l’utérus, soit seul, soit en co-test avec la cytologie (5-8). Il est prouvé que les programmes de dépistage basés sur le VPH offrent une meilleure protection contre le précancer et le cancer du col de l’utérus que les autres méthodes de dépistage traditionnelles, comme la cytologie (9-11). Cependant, comme la plupart des infections à HPV peuvent être éliminées spontanément, le test HPV identifie de nombreuses infections qui n’évolueront pas vers un pré-cancer ou un cancer du col de l’utérus, en particulier chez les jeunes femmes (12). Par conséquent, le test ADN-VPH n’est pas recommandé pour le dépistage des femmes de moins de 30 ans. De plus, les patientes HPV-positives orientées vers des procédures ultérieures peuvent souffrir d’interventions invasives inutiles.

En Chine, on a recensé 98 900 nouveaux cas et 30 500 décès dus au cancer du col de l’utérus en 2015 (13). Pour enrayer la tendance à l’augmentation de cette tumeur maligne, le gouvernement chinois a mis en place depuis 2009 un programme national de dépistage gratuit du cancer du col de l’utérus pour les femmes vivant dans les zones rurales, en utilisant l’IVA/VILI, le test de Papanicolaou (Pap) ou le test HPV (dans les sites pilotes), en fonction des niveaux de développement économique et technologique (14). Cependant, en raison de la nature de ces méthodes de dépistage, la précision du diagnostic doit être améliorée. De plus, compte tenu de la grande population chinoise, il convient d’évaluer un nouvel outil de dépistage avec un équilibre entre sensibilité et spécificité.

Les marqueurs moléculaires spécifiques du cancer du col de l’utérus offrent une combinaison de haute sensibilité et de haute spécificité pour détecter les précancers du col de l’utérus. La plupart de ces marqueurs ont été identifiés sur la base du mécanisme de la carcinogenèse liée au VPH. Le test de l’ARN du VPH est basé sur la détection de l’ARNm du VPH HR E6 et E7. Le potentiel oncogène de l’infection par le HPV dépend de la production des oncoprotéines virales E6/E7. Ainsi, la détection des transcriptions de l’ARNm E6/E7 offre la possibilité d’un test spécifique pour détecter les lésions précancéreuses.

Dans cette étude, nous avons évalué la performance clinique du test de l’ARNm E6/E7 du HPV pour détecter les néoplasies intraépithéliales cervicales (CIN) de haut grade et le cancer chez les femmes chinoises.

Matériels et méthodes

Participants et procédures

Cette étude en milieu hospitalier a été menée d’avril à décembre 2017 dans la province du Henan, en Chine. Les femmes qui se sont rendues au département de gynécologie de The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University (SAHZU) pour une colposcopie ont été invitées. Les critères d’inclusion étaient les suivants : (1) femmes âgées de 25 à 64 ans ; (2) aucun antécédent de cancer du col de l’utérus ou d’hystérectomie ; (3) aucun symptôme clinique de grossesse ou 8 semaines après l’interruption de grossesse ; et (4) compréhension des procédures de l’étude, et participation volontaire. L’étude a été approuvée par le comité d’examen institutionnel (IRB) du Henan Cancer Hospital (HCH). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de chaque participant.

Les cellules exfoliées du col de l’utérus ont été obtenues auprès des femmes lors de l’examen gynécologique. L’échantillon a été préservé dans 20 ml de milieu de transport PreservCyt® (Hologic Inc., Marlborough, MA, États-Unis) et conservé à 4°C. Ensuite, un examen colposcopique a été réalisé par un gynécologue. Les femmes présentant des résultats anormaux à la colposcopie ont subi une biopsie ciblée sur les lésions. Si l’examen colposcopique n’était pas satisfaisant (la jonction pavimento-cylindrique n’était pas complètement visible), un curetage endocervical (ECC) était effectué. Les spécimens de cellules exfoliées du col de l’utérus ont été transportés au Cancer Institute and Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (CICAMS). Les spécimens ont été divisés en deux parties : un mélange de cellules de 1,5 ml dans un tube EP pour le test ADN HR-HPV et le test ARNm HPV E6/E7. Le préservatif résiduel avec les cellules exfoliées a été utilisé pour le test cytologique ThinPrep (TCT) (Hologic Inc., Marlborough, MA, États-Unis). Le système de rapport de Bethesda a été utilisé pour la cytologie par un cytologiste senior (15).

Dosage de l’ADN du VPH-Hr

Les échantillons de mélange cellulaire de 400 μl provenant de tubes EP de 1,5 ml ont été utilisés pour la détection de l’ADN de 14 types de VPH-Hr (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 et 68) par le test Cobas 4800 HPV (Roche, Bâle, SUI). Il a permis d’obtenir simultanément le résultat groupé des 14 hrHPV et le résultat séparé pour les HPV 16 et 18 (16). Le Cobas 4800 était un test de détection de l’ADN du VPH basé sur la PCR avec amplification par hybridation d’acide nucléique, conformément aux instructions du fabricant. Des contrôles de qualité négatifs et positifs ont été définis dans chaque test. Si la valeur ct était supérieure à 40, le résultat était considéré comme négatif. Dans le cas contraire, le résultat était positif. Les résultats positifs comprenaient trois types : HPV 16, HPV 18 et HPV autres (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 et 68).

Test ARNm E6/E7 du HPV

Des échantillons d’un ml provenant de tubes EP de 1,5 ml ont été utilisés pour la détection de l’ARNm viral E6/E7 des types de HPV de 14 h dans le test APTIMA HPV agrégé (Hologic Inc, Marlborough, MA, États-Unis), conformément aux instructions du fabricant (17). Il s’agissait d’un test en trois étapes, comprenant l’extraction de l’ARNm, l’amplification et la détection du produit amplifié. Si le nombre de copies était supérieur ou égal à 1,0, le résultat était considéré comme positif. Sinon, le résultat était négatif.

Diagnostic histopathologique

Les tissus de la biopsie et de l’ECC ont été envoyés à SAHZU pour les diagnostics histopathologiques selon le système de déclaration des néoplasies cervicales intraépithéliales (CIN). Ensuite, des histopathologistes du HCH ont examiné toutes les lames. Tout diagnostic pathologique incohérent a été envoyé au CICAMS pour arbitrage. Le diagnostic final pour chaque femme était basé sur la plus mauvaise lecture de l’examen du panel. Tous les processus de détection et de diagnostic étaient en aveugle.

Analyse statistique

Le diagnostic histopathologique final a été utilisé comme étalon-or. Les femmes dont le diagnostic par TCT était une lésion malpighienne intraépithéliale de bas grade (LSIL) ou pire (LSIL +) ont été considérées comme positives à la cytologie en phase liquide (CPL). Les résultats de l’ADN du VPH ont été stratifiés en fonction des types de VPH : HPV16/18 (c’est-à-dire HPV16 et/ou HPV18 positifs), HPV-autres (c’est-à-dire n’importe lequel des 12 types de HPV hr positifs, à l’exclusion de HPV16 et HPV18) et HPV-total (c’est-à-dire n’importe lequel des 14 types de HPV hr positifs). Les estimations absolues et les intervalles confidentiels à 95% (IC95%) des taux de positivité, de la sensibilité, de la spécificité, de la valeur prédictive positive (VPP) et de la valeur prédictive négative (VPN) ont été calculés. Les différences d’expression de l’ARNm du VPH dans les différents groupes de VPH ont été calculées à l’aide du test du chi carré ou du test exact de Fisher. Le test de McNemar a été utilisé pour identifier les différences de sensibilité et de spécificité. Le niveau α a été fixé à 0,05, et p < 0,05 (taille deux) a été considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

Au total, 537 femmes ont été incluses dans cette analyse. L’âge moyen était de 43,88 ± 10,97 ans. Les diagnostics de CPL étaient : 183 (34,7%) normal, 135 (25,1%) cellules malpighiennes atypiques de signification indéterminée (ASC-US), 22 (4,1%) cellules malpighiennes atypiques ne pouvant exclure une HSIL (ASC-H), 7 (1.3 %) cellule glandulaire atypique (AGC), 82 (15,3 %) LSIL, 75 (14,0 %) lésion malpighienne intra-épithéliale de haut grade (HSIL), 31 (5,8 %) carcinomes malpighiens (SCC) et 2 (0,4 %) adénocarcinomes in situ (AIS). Les diagnostics histopathologiques étaient les suivants : 298 (55,5 %) normaux, 30 (5,6 %) néoplasie intraépithéliale cervicale de grade 1 (CIN1), 48 (8,9 %) CIN2, 111 (20,7 %) CIN3, 43 (8,0 %) SCC et 7 (1,3 %) AIS.

Le tableau 1 a montré la corrélation entre la détection de l’ARNm et de l’ADN par types de VPH. La concordance totale des deux tests était de 90,7% (95%CI : 87,9, 92,9) avec une valeur kappa de 0,81. Les taux de positivité de l’ARNm étaient de 91,7 %, 84,6 % et 86,4 % chez les femmes positives pour les VPH16/18, les VPH-autres et les VPH-total, respectivement. Tous les taux positifs d’ARNm étaient plus élevés chez les femmes HPV-positives que chez les femmes HPV-négatives dans le même groupe de type de HPV (tous les p < 0,001).

Les taux de positivité de l’ADN, de l’ARNm et de la CPL du VPH augmentent avec la sévérité du diagnostic histopathologique, ils varient respectivement de 25,5, 19,1 et 11,4 % dans les cas normaux à 100,0 % dans les cas de CSC. Les taux de positivité des trois tests dans les AIS étaient respectivement de 85,7, 85,7 et 100,0 %. Ces trois tests avaient des taux de positivité similaires dans les cas de CIN3, SCC et AIS. Mais les taux de positivité de l’ARNm étaient relativement plus faibles chez les femmes sous diagnostic de CIN2. Les taux de positivité du HPV16 étaient les plus élevés dans les cas de CIN3, SCC et AIS par rapport aux autres groupes d’ADN de HPV. Les taux de HPV18 positifs étaient inférieurs à 7% dans toutes les lésions épidermoïdes, mais un peu plus élevés (28,6%) dans les AIS (tableau 2).

Le tableau 3 a montré la performance clinique des trois tests dans la détection des lésions CIN2+ et CIN3+. Les sensibilités de l’ARNm pour détecter les lésions CIN2+ et CIN3+ étaient respectivement de 93,8 % (IC95 % : 89,7-96,4) et 95,7 % (IC95 % : 91,3-97,9), ce qui n’était pas différent de celles détectées par l’ADN (95,7 % pour les CIN2+, 96,3 % pour les CIN3+), mais supérieur à celles détectées par la CPL (80,4 % pour les CIN2+ et 88,8 % pour les CIN3+). Les spécificités de l’ARNm pour la détection des CIN2+ (79,0 %) et des CIN3+ (70,5 %) étaient significativement plus élevées que celles de l’ADN (71,0 % pour les CIN2+, 62,8 % pour les CIN3+) (p < 0,05), mais plus faibles que celles de la CPL (84,5 % pour les CIN2+, 79,8 % pour les CIN3+). Les VPP de l’ARNm pour détecter les CIN2+ et les CIN3+ étaient de 74,0 % (IC95 % : 68,4-78,9) et 58,1 % (IC95 % : 52,1-63,9), et les VPN étaient de 95,2 % (IC95 % : 92,0-97,2) et 97,4 % (IC95 % : 94,8-98,8), respectivement.

Les tableaux 4, 5 ont montré les taux de positivité et les performances cliniques des trois tests dans différents groupes d’âge. En résumé, tous les tests ont montré une meilleure performance chez les femmes de plus de 30 ans que chez les femmes plus jeunes. Le test ADN HPV avait la sensibilité la plus élevée, et la CPL avait la spécificité la plus élevée pour détecter les CIN2+ et CIN3+ chez les femmes de moins de 30 ans.

Discussion

Les résultats présentés ont montré que le test ARNm et la tétine ADN ont atteint un accord élevé de 90,7%. Les taux de positivité de l’ADN du HPV, de l’ARNm et de la CPL ont augmenté avec la sévérité du diagnostic histopathologique, passant respectivement de 25,5, 19,1 et 11,4 % dans le cas d’un cancer normal à 100,0 % dans le cas d’un CSC. Les sensibilités de l’ARNm pour détecter les CIN2 et CIN3+ étaient de 93,8 % et 95,7 %, ce qui était similaire à celles de l’ADN (95,7 % pour les CIN2+ et 96,3 % pour les CIN3+). Mais les spécificités pour l’ARNm (79,0 % pour les CIN2+ et 70,5 % pour les CIN3+) étaient significativement plus élevées que celles détectées par l’ADN (71,0 % pour les CIN2+ et 62,8 % pour les CIN3+).

Dans cette étude, le test ARNm HPV E6/E7 et le test ADN HPV ont montré une grande concordance. Parmi les femmes positives pour l’ADN du HPV 16/18, 91,7 % étaient également positives pour l’ARNm, ce qui est similaire à d’autres études qui ont signalé une concordance globale de plus de 90 % entre le test APTIMA HPV et les tests ADN HPV (17, 18), et des taux de positivité constamment plus élevés pour le test ADN HPV dans différentes populations (19, 20). Nous avons constaté des taux de positivité plus élevés chez les femmes âgées que chez les jeunes femmes, ce qui diffère légèrement d’autres études (21-23). Cette variation peut être attribuée à la conception de l’étude (c’est-à-dire une étude en milieu hospitalier), qui limite l’extrapolation des résultats à la population générale. Il est intéressant de noter que le taux de discordance était plus élevé chez les femmes âgées de 30 ans ou moins (25,6 % contre 8,6 %). Des études ont démontré un taux plus élevé de clairance spontanée de l’infection par le VPH chez les femmes plus jeunes, ce qui indique une moindre possibilité d’intégration du VPH (24).

Comme nous le savons, les tests VPH basés sur l’ADN détectent la présence ou l’absence de l’ADN du VPH. Cependant, la plupart des infections par le VPH sont transitoires et disparaissent spontanément en un an, sans évoluer vers un précancer ou un cancer du col de l’utérus (25). L’expression de l’ARNm E6/E7 ne se produit que dans les cellules activement infectées et augmente pendant le développement et la progression de la CIN (26). Par conséquent, le test de l’ARNm du VPH est censé être plus spécifique pour détecter les lésions cervicales de haut grade. Nos données ont confirmé cette hypothèse. Nous avons constaté que le test ARNm était aussi sensible que le test ADN, mais plus spécifique dans la détection des lésions précancéreuses et cancéreuses du col. D’autres chercheurs ont tiré des conclusions similaires dans le cadre du dépistage primaire (20) ou du triage des femmes présentant des anomalies mineures à la cytologie (27). Dans notre étude, 50 femmes avaient des résultats discordants entre le test ADN HPV et le test ARNm. Parmi elles, 34 ADN + /ARNm- contre 8 ARNm + /ADN- ont été diagnostiqués comme normaux ou CIN1 ; 6 contre 2 ont été diagnostiqués comme CIN2 ou CIN3 ; aucune différence de test n’a été observée dans les cancers. Par conséquent, si nous remplaçons le test ADN HPV par le test ARNm, 34 femmes ne seraient pas orientées vers une colposcopie inutile, mais 4 CIN2 et 2 CIN3 seraient manquées. Malgré les 6 cas manquants, il n’y a pas eu de perte de sensibilité, mais la spécificité a augmenté. La littérature a montré que 40 à 60 % des cas de CIN2 régresseraient dans les 2 ans (28, 29), et que tous les cas de CIN3 n’étaient pas de véritables lésions précancéreuses (30). Cook et al. ont également constaté un faible taux de CIN2+ chez les femmes ARNm/ADN+ (17). Par conséquent, le risque de cancer invasif pour les 6 femmes était faible dans un intervalle de temps court.

Nous avons également évalué la performance du test chez les femmes plus âgées et plus jeunes. L’analyse spécifique à l’âge a révélé que les trois tests fonctionnaient mieux chez les femmes de plus de 30 ans. Compte tenu du fait que les femmes plus jeunes présentant des lésions CIN avaient une plus grande possibilité de régression, nous suggérons une prise en charge conservatrice des femmes plus jeunes. Des études ont montré que l’infection par le VPH était fréquente chez les jeunes femmes, mais qu’une grande partie d’entre elles étaient des infections transitoires, et pouvaient être éliminées spontanément (31, 32). La courte durée de la plupart des infections à VPH chez ces femmes suggère que la dysplasie cervicale associée doit être prise en charge de manière conservatrice (12). Par conséquent, le test ADN-VPH peut ne pas être une méthode de dépistage appropriée pour les femmes de moins de 30 ans, en raison du taux élevé de faux positifs. Il convient d’évaluer les performances de dépistage de la cytologie et de l’ARNm E6/E7 de manière exhaustive chez les jeunes femmes. Dans notre étude, les données ont montré que la cytologie avait la spécificité la plus élevée chez les femmes de moins de 30 ans, mais que la sensibilité était inférieure à celle du test ADN HPV. Cependant, pour l’ARNm E6/E7, il avait une performance modérée chez les femmes de moins de 30 ans, qui avait une sensibilité plus élevée que la cytologie accompagnée d’une spécificité plus élevée que l’ADN du VPH, ce qui suggère que le test de l’ARNm E6/E7 pourrait être une option prometteuse pour le dépistage des femmes de moins de 30 ans.

Bien que la Food and Drug Administration chinoise ait approuvé trois vaccins prophylactiques contre le VPH (c’est-à-dire Cervarix, Gardasil et Cecolin), la prévention du cancer du col de l’utérus repose toujours sur le dépistage. En 2009, le gouvernement chinois a lancé un dépistage gratuit du cancer du col de l’utérus à l’échelle nationale pour les femmes rurales. En 2015, le test ADN du VPH a été utilisé pour la première fois comme outil de dépistage primaire dans des sites pilotes. Cependant, en raison de sa grande population, le dépistage basé sur l’ADN du VPH entraînerait d’énormes faux positifs inévitables, entraînant un gaspillage des ressources de santé et une anxiété inutile. Il est prometteur que l’ARNm puisse être utilisé dans le programme national de dépistage du cancer du col de l’utérus pour réduire les faux positifs sans perdre de sensibilité.

Plusieurs limites doivent être abordées dans cette étude. Premièrement, il s’agit d’une étude transversale et nous n’avons pas pu évaluer le risque de progression des lésions associé à l’ARNm du VPH E6/E7. Cependant, nous avons stratifié nos données par grade histologique, ce qui fournit des informations sur la corrélation. Deuxièmement, il est important de noter que les résultats ne peuvent pas être entièrement généralisés à la population générale, car les participants à l’étude ont été recrutés en consultation externe à l’hôpital.

En conclusion, le test APTIMA mRNA avait une bonne concordance avec le test Cobas 4800 HPV DNA avec une sensibilité similaire et une spécificité plus élevée pour détecter les lésions cervicales de haut grade. Il est prometteur que l’ARNm puisse être utilisé dans le programme national chinois de dépistage du cancer du col de l’utérus pour réduire le nombre de faux positifs sans perdre en sensibilité. D’autres études sont nécessaires pour évaluer la performance clinique du test ARNm chez les femmes plus jeunes en Chine.

Data Availability Statement

Tous les ensembles de données générés pour cette étude sont inclus dans l’article/le matériel complémentaire.

Ethics Statement

Les études impliquant des participants humains ont été examinées et approuvées par le rôle de la coexpression de l’ARNm du VPH E6/E7 et de la protéine p16/Ki-67 dans la prédiction du risque de cancer du col de l’utérus. par le Comité d’examen éthique des sciences de la vie de l’Université de Zhengzhou. Les patients/participants ont fourni leur consentement éclairé écrit pour participer à cette étude.

Contributions des auteurs

S-KZ a contribué à la conception et a rédigé le manuscrit. ZG a contribué à la rédaction et à la révision du manuscrit. PW, M-MJ et P-PG ont contribué à l’enquête et au test ADN HPV. L-NK et Z-NW ont contribué au test de l’ARNm du VPH. D-MZ a contribué à l’examen cytologique et histologique. QC et X-QC ont effectué l’analyse statistique. X-BS a participé à la conception de l’étude et aux analyses statistiques. Y-LQ et J-GZ ont aidé à la conception de l’étude et à la rédaction du manuscrit. J-GZ a participé à la mise en œuvre de l’étude. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Funding

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° 81502475) et le projet de science et de technologie de la province du Henan (subvention n° 172102310067).

Conflit d’intérêt

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêt potentiel.

Remerciements

Toutes les femmes impliquées dans cette étude sont remerciées pour leur participation. Nous avons également apprécié la contribution de tous les médecins concernés par cette étude et l’aide du National Cancer Center, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, et Peking Union Medical College. Nous avons également apprécié la 32e Conférence internationale sur le papillomavirus (IPVC 2018) pour avoir fourni une plateforme permettant de présenter le résumé de l’étude (titre : Clinical Performance of HPV E6/E7 mRNA test to Detect Cervical High-grade Intraepithelial Neoplasia and Cancer : A Hospital-based Study in China, IPVC8-0744 Poster Session).

Abréviations

hr-HPV, papillomavirus humain à haut risque ; VIA/VILI, inspection visuelle à l’acide acétique/inspection visuelle à la solution d’iode de Lugol ; Pap, papanicolaou ; SAHZU, Second hôpital affilié de l’Université de Zhengzhou ; IRB, Institutional Review Board ; HCH, Henan Cancer Hospital ; CICAMS, Cancer Institute and Hospital Chinese Academy of Medical Sciences ; 95%CI, intervalles confidentiels à 95% ; ECC, curetage endocervical ; TCT, test cytologique ThinPrep ; CIN, néoplasie cervicale intraépithéliale ; LSIL, lésion malpighienne intraépithéliale de bas grade ; HSIL, lésion malpighienne intraépithéliale de haut grade ; CPL, cytologie en phase liquide ; VPP, valeur prédictive positive ; VPN, valeur prédictive négative ; ASC-US, cellules malpighiennes atypiques de signification indéterminée ; ASC-H, cellule malpighienne atypique ne pouvant exclure une HSIL ; AGC, cellule glandulaire atypique ; SCC, carcinomes malpighiens ; AIS, adénocarcinome in situ.

.