Evaluation de la diversité microbienne des bactéries dénitrifiantes en réacteur discontinu

Ingénierie des bioprocédés

Evaluation de la diversité microbienne des bactéries dénitrifiantes en réacteur discontinu

S. I. MaintinguerI,* ; I. K. SakamotoII ; M. A. T. AdornoII ; M. B. A. VarescheII,*

ABSTRACT

Les communautés microbiennes dans une station industrielle à boues activées peuvent contribuer au processus de dénitrification, mais les informations sur les microorganismes présents dans les réacteurs de dénitrification sont encore rares. L’élimination des composés azotés inorganiques peut être réalisée par l’ajout de sources de carbone au processus biologique de dénitrification. L’éthanol est une alternative économiquement viable comme source de carbone dans les pays tropicaux comme le Brésil, avec une production à grande échelle à partir de la canne à sucre. Cet article rapporte l’application réussie de boues activées avec du nitrate et de l’éthanol dans un réacteur anaérobie batch. L’opération a duré 61,5 heures avec une consommation totale de nitrate en 42,5 heures, la génération de nitrite (2,0 mg/L) et la consommation d’éthanol (830,0 mg/L) en 23,5 heures. Les dénombrements de cellules dénitrifiantes par le nombre le plus probable au début de l’opération étaient plus faibles qu’à la fin, confirmant l’aptitude de l’inoculum de boues activées pour le processus de dénitrification. Les échantillons provenant de la numération cellulaire ont été identifiés comme Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Comamonas sp. et des bactéries non cultivées. Par conséquent, ces espèces peuvent être impliquées dans la réduction des nitrates et la consommation d’éthanol dans le réacteur discontinu.

Mots clés : Système de boues activées ; Acidovorax ; Acinetobacter ; Nitrate ; Ethanol.

INTRODUCTION

Les micro-organismes capables de dénitrification sont largement distribués dans la nature : sol, sédiments, eau douce, mer et systèmes de traitement des eaux usées (Park & Yoo, 2009).

De nombreux inocula provenant de stations d’épuration domestiques et industrielles peuvent contenir des bactéries dénitrifiantes, principalement dans les systèmes à boues activées (Liu et al., 2006 ; Daniel et al., 2009), où l’élimination biologique de l’azote se produit pour favoriser la dénitrification, c’est-à-dire que dans des conditions anoxiques hétérotrophes, les sources de carbone organique agissent comme des donneurs d’électrons et réduisent le nitrate en azote gazeux (Canto et al., 2008). La présence de carbone organique et de sources d’énergie est nécessaire pour la dénitrification hétérotrophe (Nava et al., 2010).

La plupart des bactéries dénitrifiantes sont englobées dans le phylum des protéobactéries, y compris Acidovorax, Comamonas et Acinetobacter, entre autres. Ces bactéries peuvent être présentes dans le traitement des déchets, notamment dans les systèmes à boues activées, et sont capables de former de l’azote moléculaire à partir de nitrates et d’une source de carbone exogène, comme l’éthanol. La dénitrification complète, c’est-à-dire la transformation du nitrate en azote gazeux, est assurée par des espèces bactériennes qui utilisent normalement l’oxygène de l’air comme source d’énergie (respiration aérobie), mais qui ont également la capacité d’utiliser le nitrate et le nitrite au lieu de l’oxygène (condition anoxique). Ainsi, ces bactéries peuvent se développer en aérobie en l’absence de nitrate, ou dans des conditions anoxiques en présence de nitrate. La conversion du nitrate en azote moléculaire est également connue sous le nom de respiration anoxique (Park & Yoo, 2009).

Une grande variété de composés organiques a été utilisée, comme le méthanol, l’éthanol, le glucose, l’acétate, l’aspartate ou l’acide formique et les composés aromatiques (Queiroz et al., 2011). Cependant, la plupart des recherches publiées concernant la dénitrification de l’eau potable impliquent l’utilisation de méthanol, d’éthanol et d’acide acétique (Park & Yoo, 2009). L’éthanol (Daniel et al., 2009), le glucose et l’acétate sont quelques-uns des donneurs d’électrons externes utilisés avec succès pour la dénitrification. En particulier au Brésil, l’éthanol représente une alternative réalisable (Gavazza dos Santos et al., 2004). L’éthanol est produit à grande échelle au Brésil depuis 1975, avec le programme national pour l’alcool (19751985). Le Brésil produit près de 2,6 x 108 tonnes de canne à sucre, qui sont traitées par 324 sucreries pour produire du sucre et de l’éthanol (Borrero et al., 2003). L’éthanol est produit en abondance à partir de la canne à sucre et coûte généralement moins cher que d’autres sources de carbone pratiques. Néanmoins, la nécessité de sources supplémentaires de donneurs d’électrons pour le processus exogène augmente les coûts opérationnels, représentant éventuellement un inconvénient pour l’utilisation de technologies innovantes basées sur le processus anaérobie (Gavazza dos Santos et al, 2004).

Les relations stœchiométriques décrivant la réaction énergétique bactérienne (Park & Yoo, 2009) s’écrivent comme suit, lorsque l’éthanol est utilisé comme source de carbone :

0,69 C2H5OH + NO3 + H+ → 0.14 C5H7NO2 +0,43 N2 + 0,67 CO2 + 2,07 H2O

Bien que cette équation révèle la quantité stœchiométrique d’éthanol nécessaire à la dissimilation des nitrates, de l’éthanol supplémentaire est nécessaire pour la désoxygénation et la synthèse cellulaire. En pratique, 25 à 30 % de l’éthanol nécessaire est utilisé pour la synthèse des cellules bactériennes. En présence d’oxygène dissous, les besoins en éthanol sont d’autant plus élevés. Par conséquent, une valeur de travail commune du rapport pondéral du substrat au nitrate (C:N03) est proche de 3 (Park & Yoo, 2009).

Il n’existe que quelques références sur les réacteurs discontinus et le processus de dénitrification. Ces configurations peuvent être utilisées pour étudier les besoins nutritionnels (Maintinguer et al., 2008). Le processus de dénitrification avec des hydrates de carbone complexes est évalué dans des réacteurs batch car la matière organique particulaire qui est présente dans ces systèmes peut rendre difficile le fonctionnement dans d’autres configurations, comme avec de l’amidon (Iamamoto, 2006). En outre, la biomasse reste retenue dans le réacteur discontinu pendant toutes les périodes d’exploitation, par rapport aux réacteurs à flux continu. Ces faits peuvent contribuer à la consommation totale de nitrate vérifiée dans le réacteur discontinu (Etchebehere et al., 2001 ; Gavazza dos Santos et al., 2004).

L’élimination des nitrates avec un inoculum de boues activées a été étudiée particulièrement dans les pays à climat tempéré. Il y a peu de rapports d’études sur l’élimination des nitrates et la biologie moléculaire avec l’inoculum de boues activées des pays tropicaux comme le Brésil. Dans ce sens, le premier objectif de notre étude était d’évaluer le processus de dénitrification avec des boues activées comme inoculum provenant de climats tropicaux. Le second objectif de notre étude était de réaliser une caractérisation microbienne de l’inoculum visant à identifier les organismes potentiels spécifiquement impliqués dans le processus de dénitrification.

Ce travail a étudié la diversité microbienne de la dénitrification dans un réacteur batch alimenté en éthanol et en nitrate en utilisant des techniques de biologie moléculaire et la méthodologie traditionnelle de la microbiologie.

MATERIEL ET METHODES

Réacteur discontinu

L’expérience a été réalisée avec des boues provenant du système de boues activées de la station d’épuration des eaux usées de Volkswagen São Carlos (São Carlos SP – Brésil).

Les réacteurs batch ont été préparés en triplicata dans des flacons Duran® de 2 L, où 1 L était le milieu réactionnel, 10% (v/v) d’inoculum (100 mL/L).

Les réacteurs ont été soumis à une atmosphère de N2 (99,99%) pendant 20 min après la distribution des solutions. Après cela, ils ont été bouchés avec des bouchons en caoutchouc butyle, enveloppés et maintenus à 25 ºC ± 1 ºC, avec une agitation à 120 rpm opérée pendant 61,5 h.

Analyse physico-chimique et chromatographique

Les solides volatils totaux (TVS) et la consommation de nitrate ont été déterminés selon APHA, 2005, par spectrophotométrie. L’analyse des nitrites a été réalisée par injection de flux (FIA APHA, 2005). Les acides gras volatils et les alcools ont été déterminés par chromatographie en phase gazeuse dans un Shimadzu GC-2010, équipé d’un détecteur à ionisation de flamme, d’un échantillonneur automatique pour l’espace de tête COMBI-PAL – AOC modèle 5000 et d’une colonne HP-INNOWAX (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm d’épaisseur de film), selon Maintinguer et al, 2008).

Quantification des bactéries dénitrifiantes

Le nombre le plus probable (NPP) de bactéries dénitrifiantes a été réalisé à cinq fois la dilution au début et à la fin du fonctionnement du réacteur discontinu, selon Tiedje (1982), adapté aux échantillons liquides. Les comptages cellulaires par la méthode MPN ont été réalisés après 15 jours d’incubation, selon APHA, 2005. La composition du milieu de culture et, les concentrations de nitrate et d’éthanol utilisées dans les essais NPP étaient similaires à celles du fonctionnement en réacteur discontinu, comme mentionné précédemment.

Biologie moléculaire

Les échantillons pour l’analyse de l’ARNr 16S ont été obtenus à partir des comptes de dilution positive (NPP) les plus élevés de bactéries dénitrifiantes à la fin de l’essai des réacteurs discontinus.

L’ADN génomique total des échantillons a été acquis après lyse cellulaire avec des billes de verre (Sigma) et extraction phénol-chloroforme comme décrit précédemment par Griffiths et al. (2000) modifié.

L’amplification par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) a été réalisée avec un ensemble d’amorces du domaine bactérien pour le gène de l’ARNr 16S, 27 en sens direct (5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′) et 1100 en sens inverse (5′-AGGGTTGCGCTCGTTG-3′) (Lane, 1991). L’amplification par PCR (Thermo cycler Eppendorf AG – Hamburg 22,331) a été réalisée avec une dénaturation initiale à 94 ºC pendant 5 min suivie de 30 cycles de dénaturation à 94 ºC pendant 45 s, de recuit à 55 ºC pendant 45 s, d’extension à 72 ºC pendant 1,45 min et d’extension finale à 72 ºC pendant 7 min et refroidissement à 4 ºC.

Des échantillons de produits PCR (Polymerase Chain Reaction) (16S rRNA) ont été clonés dans le vecteur plasmidique pGEM (Promega Easy Vector System I) selon les spécifications du fabricant. Les clones ont été sélectionnés au hasard et amplifiés par PCR. Le séquençage des nucléotides a été effectué sur un séquenceur automatisé ABI 310 PRISM (Dye terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, USA) conformément aux instructions du fabricant en utilisant une amorce directe M13 (50-GTAAAA CGA CGG CCA G-30) (Messing, 1983). L’amplification par PCR (Thermo cycler Eppendorf AG Hamburg 22, 331) a été réalisée avec une dénaturation initiale à 94 ºC pendant 2 min, suivie de 25 cycles de dénaturation à 94 ºC pendant 1 min, de recuit à 55 ºC pendant 1 min, d’extension à 72 ºC pendant 1 min ; et d’extension finale à 72 ºC pendant 7 min et de refroidissement à 4 ºC.

Les séquences nucléotidiques ont été traitées et elles ont été alignées avec le programme Seqman (paquet Lasergene DNAstar) pour éliminer les signaux du vecteur et les bases de faible qualité. Les séquences alignées ont été déterminées par le programme de recherche BLAST sur le site web du NCBI et comparées aux séquences d’organismes du gène 16S rRNA représentées dans la base de données Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) et Ribosomal Data Base Project (http://rdp.cme.smu.edu). L’arbre phylogénétique a été construit par la méthode Neighbor-Joining (Saitou & Nei, 1987) en utilisant le programme MEGA version 4.1 (Kumar et al., 2008). Une analyse de rééchantillonnage Bootstrap pour 1000 répliques a été réalisée pour estimer la confiance des topologies d’arbres. Les séquences connues d’Aspergillus niger (FJ828924.1) ont été ajoutées et il a été utilisé comme out-group.

RESULTATS ET DISCUSSION

Le nitrate a été complètement consommé après 42,5 h de fonctionnement (Figure 1). La génération de nitrite a été réduite (2,0 mg/L à 18,5 h) et s’est produite dans les 23,5 heures de fonctionnement. 1,06 g d’éthanol/L (consommation de 36 %) a été observé après 13,5 h de fonctionnement pour une concentration initiale de 1 650 mg/L. La consommation d’éthanol à la fin de l’expérience était de 54 % (0,77 g/L en 61,5 h). Ces résultats sont proches de ceux de Gusmão et al. (2006). Les auteurs (op.cit.) ont observé 98,9% de la consommation de nitrate en 14 h de fonctionnement, avec des cellules purifiées de boues granulaires provenant d’un lit de boues anaérobies à flux ascendant (UASB) traitant les eaux usées d’un abattoir de volailles (DAKAR-Tietê SP Brésil), avec du nitrate (350 N-NO3 mg/L), de l’éthanol (377 mg/L) et du benzène (10 mg/L) comme sources de carbone.

Le méthanol (197,78 mg/L) et le n-butanol (23,50 mg/L) ont été détectés au début de l’expérience. Ces alcools (métanol et n-butanol) étaient peut-être présents dans l’inoculum. La concentration des alcools a montré peu de variation jusqu’à la fin de l’essai, indiquant qu’ils n’ont pas été consommés dans cette condition de dénitrification (Figure 2).

La génération maximale d’acide acétique était de 16,7 mg/L à 61,5 h de fonctionnement. Les valeurs de la VST au début et à la fin du fonctionnement du réacteur discontinu étaient respectivement de 5,14 g/L et 11,40 g/L, ce qui indique une augmentation de 122% de la biomasse. Ces résultats ont montré que les conditions opérationnelles imposées au réacteur batch ont bénéficié au développement et à la permanence du consortium bactérien dans des conditions de dénitrification.

Dans cette étude, le processus de dénitrification a été observé, comme cela a également été décrit par d’autres auteurs utilisant différentes configurations pour les réacteurs.

Callado &Foresti (2001) a fait fonctionner des réacteurs anaérobies alimentés par un substrat synthétique simulant les eaux usées domestiques afin d’éliminer la plus grande fraction de matière carbonique et de promouvoir la nitrification du substrat, la dénitrification et l’élimination biologique des phosphates dans le même cycle batch, dans un réacteur batch anaérobie/aérobie/anaérobie séquentiel. Le système a été exploité pendant 41 jours avec 84 cycles de 12 heures, à la température de 28±1 ºC. Les auteurs (op.cit,) ont observé que la dénitrification s’est produite dans des conditions alternativement aérobies et anoxiques dans la phase de réaction. Les deux processus se sont produits seulement lorsque l’acétate de sodium (500 mg/L) a été ajouté au début de la phase anoxique.

Etchebehere et al. (2001), ont testé l’acétate (40 mmol/L) et le glucose (13 mmol/L) comme sources de carbone pour la dénitrification dans un réacteur anaérobie discontinu avec du nitrate de potassium (20mmol/L) pour trois inocula différents : boue provenant d’un réacteur anoxique (échelle de laboratoire) pour éliminer le carbone et l’azote du lixiviat d’une décharge sanitaire ; boue provenant d’un réacteur méthanogène UASB traitant le maltage et boue provenant d’un réacteur anoxique alimenté en acétate et en nitrate. Le nitrate a été complètement consommé par les trois échantillons de boues testés, comme observé dans la présente étude. Les auteurs (op. cit.) ont conclu que l’acétate est une meilleure source de carbone que le glucose.

Gavazza dos Santos et al. (2004) ont étudié le processus de dénitrification réalisé dans des réacteurs batch alimentés avec des eaux usées synthétiques simulant les effluents nitrifiés des stations d’épuration domestiques en utilisant trois sources de donneurs d’électrons : le méthanol (53,3 mg/L), l’éthanol (38,3 mg/L) et le méthane (en plus des eaux usées synthétiques). Les auteurs (op.cit.) ont observé que le donneur d’électrons le plus efficace était l’éthanol, qui éliminait complètement les nitrites et les nitrates, comme observé dans ce travail.

Iamamoto (2006) a obtenu une élimination de l’azote supérieure à 84% dans un réacteur batch séquentiel alimenté par de l’amidon et de l’ammonium alternant des conditions anoxiques et aérobies (cycles 2h/2h) et 2 mg O2/L pour les concentrations suivantes : 125 mg N-NH4/L et 0,95 g d’amidon/L, 250 mg N-NH4/L et 1,9 g d’amidon/L, 500 mg N-NH4/L et 3.8 g d’amidon/L, avec un inoculum provenant d’un système de boues activées d’une station de traitement des eaux usées (Flores da Cunha Rio Claro SP Brésil). L’éthanol (1,500 mg/L) a également été testé comme source de carbone avec 500 mg de NH4-N/L. Les auteurs (op.cit.) ont observé que l’élimination des nitrites et des nitrates était complète (100%), comme observé dans la présente étude, démontrant la faisabilité de l’utilisation de l’éthanol dans le processus de dénitrification.

La numération des cellules dénitrifiantes par NPP au début de l’opération du réacteur discontinu était plus faible (1,1 x 1010 NPP/mL) qu’à la fin de l’opération (1,2 x 1019 NPP/mL) (Figure 3). Ces résultats sont plus élevés que ceux rapportés dans la littérature, décrits ci-dessous.

Etchebehere et al. (2001) ont dénombré les cellules dénitrifiantes par le nombre le plus probable (NPP) dans un milieu basal supplémenté en extrait de levure (0,5 g/L), acétate de potassium (1,84 g/ L) et nitrate de potassium (0,72 g/ L) et ont obtenu 9,6 x 106 NPP/mL avec des boues provenant du réacteur anoxique d’un système de traitement des lixiviats. Callado et Foresti (2001) ont utilisé de l’acétate de sodium comme source de carbone dans un réacteur séquentiel anaérobie/ aérobie/anaérobie en batch et ont trouvé plus de bactéries dénitrifiantes MPN au début de l’opération (2,5 x 106 MPN/mL) qu’à la fin (3,5 x 105 MPN/mL). Les auteurs (op.cit.) ont conclu que cette diminution n’a pas affecté le processus de dénitrification.

Iamamoto (2006) a obtenu le même ordre de grandeur dans le NMP des bactéries dénitrifiantes à la fin de l’opération d’un réacteur séquentiel discontinu avec 250 mg N-NO3/L (3,9 x 106 NMP/mL) et 500 mg N-NO3/L (1.1 x 106 MPN/mL), tous deux avec ajout d’amidon (1 900 mg/L) comme source de carbone et inoculum de boues activées provenant d’une station d’épuration (Rio Claro SP – Brésil).

Les bactéries dénitrifiantes ont été favorisées par la condition nutritionnelle imposée dans le réacteur anoxique. Ce fait a confirmé la capacité de l’inoculum des boues activées pour le processus de dénitrification.

Une cinquantaine de clones ont été obtenus à partir de l’échantillon analysé pour le clonage et le séquençage des fragments du gène 16S rRNA du consortium microbien. Cependant, les clones ayant des valeurs inférieures à 180 nucléotides n’ont pas été incorporés dans l’analyse phylogénétique car ils n’étaient pas suffisants pour être comparés à la base de données décrite ci-dessous. Les séquences issues du clonage et du séquençage ont été obtenues à partir de l’échantillon positif de la plus haute dilution du NPP (10-18) (tableau 1).

Acinetobacter sp. a été identifié avec les similarités de : 98% (clones 1, 8, 13, 15, 33, 43, 45, 52, 54, 62, 67, 83 et 2, 4, 18, 20, 23 et 27) et 99% (clones 6, 15, 16, 37 et 38). Il s’agit d’une bactérie Gram-négatif, non-motrice, oxydase-négative, non-fermentaire, en paires et appartenant à l’embranchement des protéobactéries, famille des Moraxellaceae. C’est un microorganisme important dans le sol, où il peut contribuer à la minéralisation, par exemple, des composés aromatiques (Geng et al., 2006). Wang et al. (2007) ont isolé des souches d’Acinetobacter dans un échantillon provenant d’un système de boues activées (Jizhuangzi Tianjin – Chine). Cette souche était capable de biodégrader le phénol (1,1 g/L) par des cellules libres et immobilisées. Geng et al. (2006) ont isolé des bactéries dégradant le phénol dans un échantillon provenant d’un système de traitement par boues activées (Singapour). Les tests biochimiques ont montré que ces microorganismes peuvent se développer en présence d’éthanol, de glucose, de saccharose et de composés aromatiques tels que le toluène, le phénol et le benzoate. Il a été décrit comme une nouvelle espèce, Acinetobacter EDP3. Les auteurs (op.cit.) ont conclu que cette espèce peut être utilisée pour éliminer les composés phénoliques ou pour la bioremédiation in situ du phénol dans les sols. Cai et al. (2009) ont identifié 58 bactéries résistantes dans un sol contaminé par l’arsenic. Les souches Acinetobacter, Agrobacterium, Arthrobacter, Comamonas, Rhodococcus, Pseudomonas et Stenotrophomonas ont été identifiées à des concentrations élevées (20 mM Ar/L). Les Acinetobacter sp. identifiés dans ce travail ont eu leur croissance due aux conditions opérationnelles imposées et pourraient contribuer à la dénitrification.

Les clones 24 et 26 étaient similaires aux Comamonas sp. avec des similitudes de 98% et 97%, respectivement. Les Comamonas sont des bactéries Gram-négatives appartenant à l’embranchement des protéobactéries, famille des Comamonadaceae. Etchebehere et al. (2001) ont isolé des bactéries dénitrifiantes Gram-négatives d’un réacteur anoxique utilisé pour le traitement des lixiviats de décharge à Montevideo (Uruguay). L’espèce isolée présentait des similitudes avec Comamonas terrigena. Cependant, ce microorganisme a été considéré comme une nouvelle espèce, nommée Comamonas nitrativorans. Il a été décrit comme une bactérie gram-négative, à flagelle polaire mobile, aérobie et chimioorganotrophe. Cette espèce s’est développée dans l’éthanol, l’acétate et le butyrate, le nitrate, le nitrite et peut réduire le nitrate en N2.

Donc, les espèces de Comamonas identifiées dans cette étude étaient présentes dans l’inoculum des boues activées et pourraient contribuer à la dénitrification qui s’est produite dans les tests.

Les clones 25, 28, 34, 36, 42 et 65 étaient similaires à Acidovorax sp. avec des similarités de 99% et 97%, respectivement (tableau 1). Acidovorax sp. appartient à l’embranchement des protéobactéries ; on le trouve facilement dans les systèmes de boues activées. Beaucoup d’espèces d’Acidovorax agissent comme des micro-organismes régulateurs des processus de traitement microbiologique dans les systèmes de boues activées. Plusieurs espèces d’Acidovorax sont utilisées dans la biodégradation des plastiques et dans l’élimination d’autres contaminants organiques, y compris les nitrophénols, le nitrobenzène et les biphényles polychlorés par dénitrification (www.cebl.autokland.ac.nz/ecogenomics/index.html). Khan et al. (2002) ont isolé des espèces de bactéries dénitrifiantes dégradant le PHBV (poly-3-hydroxy-butyrate-co-3-hydroxyvalerate) dans trois systèmes de boues activées, utilisés pour traiter les eaux usées municipales (Nagoya, Osaka et Toyohashi – Japon). Les 37 clones analysés ont montré une similarité avec des organismes appartenant à la classe des Betaproteobacteria. La plupart des clones ont montré une similarité avec l’espèce Acidovorax, confirmant que cette espèce était impliquée dans la dégradation du PHBV dans des conditions dénitrifiantes. Gentile et al. (2007) ont isolé des espèces similaires à Acidovorax, Delftia acidovorans, Pseudomonas, Chryseobacterium et Achromobacter à partir d’un réacteur dénitrifiant fonctionnant avec de l’éthanol (40,0 g/L) et de l’acide lactique (40,0 g/L) comme sources de carbone ; ils ont testé les donneurs d’électrons séparément et le nitrate (1,9 g NaNO3/L ; 2,3 g KNO3/L) a été utilisé comme source d’azote. Les auteurs (op. cit.) ont conclu que la réduction complète du nitrate en N2 était effectuée par les espèces Acidovorax, tandis que Achromobacter sp. et Delftia acidovorans étaient responsables de la dénitrification incomplète du nitrate en nitrite. Par conséquent, les espèces Acidovorax étaient présentes dans les échantillons analysés dans cette étude et elles pourraient être impliquées dans la dénitrification qui s’est produite dans le réacteur discontinu.

Des souches bactériennes non cultivées de la Famille Rhodocyclaceae ont été identifiées avec 98% de similarité (clone 9 – AY945917.1 et clones 46, 84 AY945905), comme le montre le tableau 1. Les membres de la famille Rhodocyclaceae sont des bactéries Gram-négatives appartenant à la classe des Betaproteobacteria. Ce sont des bâtonnets aérobies dénitrifiants dotés d’une capacité métabolique polyvalente. La plupart des espèces vivent dans des habitats aquatiques et des sols oligotrophes. Beaucoup d’entre elles sont présentes dans les eaux usées et jouent un rôle important dans le traitement de décontamination biologique de ces sites (http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodocyclaceae). Liu et al. (2006), ont alimenté un réacteur de dénitrification avec de la quinoléine (40 mg/L) une amine toxique utilisée dans la fabrication de teintures, de pesticides et de carburants synthétiques, du glucose (180 mg/L), du nitrate et du phosphate de potassium (C/N/P de 150:30:1). L’inoculum provenait du deuxième bassin de sédimentation du système de traitement des eaux usées de l’Industrie Shanghai Coking & Chemical Factory (Wujing, Shanghai – Japon). L’élimination de la quinoléine était de 90,2% après la période d’équilibre du réacteur (6 semaines). Les analyses biologiques moléculaires de l’inoculum et du réacteur dénitrifiant ont révélé des bactéries non cultivées, Thauera et Azoarcus dans les deux tests. Selon les auteurs, les pourcentages de clones affiliés à des bactéries appartenant à Azoarcus et Thauera étaient respectivement de 74% dans le réacteur dénitrifiant et de 4% dans l’inoculum. La connaissance des microorganismes à partir d’échantillons environnementaux dépend des conditions de laboratoire avec des cultures pures (Pace, 1997). Cependant, moins de 1% des bactéries de différents écosystèmes sont connues (Amann, 1995), ou environ 99% n’ont pas été étudiées et identifiées. Par conséquent, dans ce travail, nous nous attendions à obtenir des séquences similaires de bactéries non cultivées.

L’arbre phylogénétique obtenu avec des amorces consensus du domaine Bacteria dans les analyses de biologie moléculaire de l’expérience est illustré à la figure 4.

Les coefficients de similitude entre les différents groupes de micro-organismes étaient de 97% à 99% et ils indiquaient la présence d’espèces phylogénétiquement apparentées, sur la base des séquences d’évaluation partielle du gène de l’ARNr 16S. Les séquences connues des espèces provenaient de la base de données NCBI avec Aspergillus niger (FJ828924.1) comme séquence hors-groupe de.

Donc, les espèces Acidovorax, Comamonas et Acinetobacter identifiées dans cette étude étaient présentes dans le système de boues activées de Volkswagen São Carlos Motors et elles pourraient être impliquées dans la réduction des nitrates et la consommation d’éthanol.

CONCLUSIONS

Le potentiel de l’inoculum d’un système de boues activées et l’utilisation de l’éthanol comme source de carbone dans un processus de dénitrification ont été démontrés dans un réacteur batch.

Les valeurs de bactéries dénitrifiantes NPP obtenues dans cette étude, combinées aux résultats de l’élimination du nitrate, ont révélé la présence de bactéries dénitrifiantes dans l’inoculum provenant d’un système de boues activées, qui ont été favorisées par les conditions nutritionnelles imposées.

Les clones identifiés avaient une affiliation phylogénétique dans le phylum des Proteobacteria, la classe des Alphaproteobacteria et Gamaproteobacteria, avec Acidovorax sp, Acinetobacter sp., Comamonas sp. et des bactéries non cultivées. Ces bactéries pourraient être impliquées dans la réduction des nitrates et la consommation de l’éthanol dans le réacteur anoxique discontinu.

ACKNOWLEDGMENTS

Les auteurs remercient les subventions reçues de la FAPESP et du CNPq.

APHA, AWWA et WEF, Standard methods for the examination of water and wastewater. 22e édition, Association américaine de santé publique, Washington, DC (2005).

Iamamoto, C. Y., Élimination de l’azote dans un réacteur batch séquentiel avec biomasse en suspension traitant des eaux usées à forte concentration d’ammoniac. Thèse de doctorat, Université de São Paulo, Brésil, École d’ingénierie, Université de São Carlos, Brésil (2006).

Messing, J., Nouveaux vecteurs M13 pour le clonage. Méthodes d’enzymologie, 101 20-78 (1983).

Pace, N. R., Une vue moléculaire de la diversité microbienne et de la biosphère. Science, 276, 734-740 (1997).