Essai en plaques

L’essai en plaques peut être utilisé pour purifier une population clonale de virus ou pour déterminer le titre viral sous forme d’unités formatrices de plaques par ml (pfu/ml) de façon à pouvoir utiliser des quantités connues de virus pour infecter les cellules lors de travaux ultérieurs. Dans ce test, les monocouches cellulaires sont infectées avec un faible ratio de virus, de sorte que les cellules sporadiques sont infectées. Une couche d’agarose maintient les cellules stables et limite la propagation du virus. Lorsque chaque cellule infectée produit du virus et finit par se lyser, seules les cellules immédiatement adjacentes sont infectées. Chaque groupe de cellules infectées est appelé une plaque. Les cellules non infectées entourent les plaques. Après plusieurs cycles d’infection, les cellules infectées au centre des plaques commencent à se lyser et les cellules infectées périphériques restent entourées de cellules non infectées. Ce phénomène entraîne une réfraction de la lumière traversant les cellules infectées différente de celle des cellules non infectées environnantes, et la plaque peut être visualisée à l’œil nu ou par microscopie optique. Chaque plaque représente un seul virus. Par conséquent, les populations de virus clonaux peuvent être purifiées en isolant les plaques individuelles. Les plaques individuelles obtenues à partir de dilutions variables d’une souche virale peuvent être comptées pour déterminer le titre viral (pfu/ml) d’une transfection ou d’une souche virale donnée. L’état des cellules et leur répartition uniforme sur la surface de la plaque de culture tissulaire sont importants pour la réussite d’un test de plaque. Les cellules doivent être saines, viables à 95 % et en phase de croissance logarithmique au moment de l’essai. Les cellules agglutinées, les cellules qui ne sont pas distribuées uniformément à la bonne densité (>70%) sur la plaque, et les cellules qui n’adhèrent pas aux boîtes de culture tissulaire dans les 30 min après le placage sont préjudiciables à l’essai.

Matériels supplémentaires requis :

Agarose pour essai de plaque, Cat. N° 554766
Milieu cellulaire pour insectes non supplémenté derace
Sérum bovin fœtal
Disque de culture de tissus, 60 x 15 mm, BD Falcon™ Cat. No. 353802
Bain-marie à 42°C

Protocole

Déterminer le nombre de plaques nécessaires

Pour chaque co-transfection ou stock de virus (et contrôle positif) faire des duplications de dilutions en série (10 -3, 10 -4, 10 -5, 10 -6 ). Etiqueter chaque plaque de 60 mm avec les descriptions de l’échantillon et de la dilution.

Epandre la plaque de culture avec des cellules d’insectes

1. Epandre 2,3 x 10 6 cellules Sf9 sur chaque plaque de 60 mm. Balancez doucement les plaques d’avant en arrière, puis d’un côté à l’autre pour répartir uniformément les cellules sur la surface de la plaque. Ne jamais faire tourner la plaque, car cela entraîne une distribution inégale des cellules. Une fois que les plaques ont été ensemencées, laissez les cellules adhérer pendant 30 minutes à une heure. Pendant ce temps, préparer la solution de gélose et les dilutions virales. Visualisez, par microscopie optique, pour confirmer >70% de confluence et une distribution uniforme des cellules.

Préparation de la solution d’agarose

Les cellules ensemencées sont recouvertes d’une solution d’agarose à 1% dans le milieu cellulaire pour insectes de Grace complété par 10% de FBS.

1. Premièrement, équilibrez le bain-marie à 42°C. Déterminer le volume total de solution de gélose nécessaire : multiplier 4 ml/plaque par le nombre d’essais de plaques. De ce volume total, une moitié sera constituée de dH 2 O autoclavé + agarose pour obtenir une solution à 2%, et l’autre moitié sera constituée du milieu pour insectes de Grace complété par 10% de FBS. Pour déterminer la quantité, en grammes, d’agarose pour essai en plaques nécessaire pour obtenir une solution finale d’agarose à 1%, multipliez le volume total par 0,01. (Par exemple, 10 plaques x 4 ml = 40 ml. 40 ml X 0,01 = 0,4 gm.)
2. Ajouter la quantité appropriée de dH 2 O autoclavé dans une bouteille en verre stérile de taille appropriée. Ensuite, ajoutez LENTEMENT la quantité calculée d’agarose, tout en remuant doucement pour mélanger le dH 2 O et l’agarose. Faites chauffer le mélange au micro-ondes jusqu’à ce qu’il soit à peine bouillant. Retirez la bouteille et vérifiez que le mélange ne contient pas d’agarose non dissous. S’il y en a, continuez à chauffer. Répétez l’opération jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissous (ATTENTION : le mélange et la vapeur qui l’accompagne sont très chauds et peuvent brûler. Utilisez les équipements de sécurité/précautions appropriés). Une fois que l’agarose est complètement dissous, boucher lâchement le flacon et le transférer dans le bain-marie à 42°C. Laisser le mélange refroidir à 42°C.
3. Se procurer le milieu pour insectes de Grace et ajouter du sérum bovin fœtal à 10%. Exemple : pour 100 ml de milieu pour insectes de Grace, ajouter 10 ml de sérum bovin fœtal. Placer le mélange milieu de Grace + 10% de FBS dans le bain-marie à 42°C.

Préparer les dilutions virales en série

1. Pour chaque co-transfection, étiqueter six tubes stériles de 15 ml de 10 -1 à 10 -6 avec la description appropriée de l’échantillon. Ajouter 2,7 ml de milieu TNM-FH dans chaque tube. Ajouter 0,3 ml du surnageant de co-transfection dans le premier tube, puis passer le tube au vortex. Effectuer des dilutions en série en transférant 0,3 ml à la dilution suivante, en utilisant une pipette fraîche à chaque fois.

Infecter les cellules monocouches

1. À ce stade, les cellules ont eu largement le temps d’adhérer à la surface de la plaque. Vérifiez plusieurs plaques sous un microscope optique pour confirmer une confluence de 70% et une distribution uniforme des cellules.
2. En travaillant avec les plaques dupliquées de chaque dilution, aspirez soigneusement le milieu des cellules à l’aide d’un embout de pipette stérile de 200 µl et d’un aspirateur. Ne pas perturber le feuillet cellulaire. Ajouter 1 ml de la dilution virale appropriée à chacune des plaques en double et secouer doucement la plaque d’avant en arrière, puis d’un côté à l’autre pour répartir uniformément le virus. Répéter avec toutes les plaques et dilutions correspondantes.
3. Balancer doucement les plaques à température ambiante, sous hotte stérile, toutes les 15 minutes pendant 1 heure.

Couvrir les cellules infectées avec de l’agarose

1. Après 1 heure, confirmer que la solution d’agarose est à 42°C. La solution doit être suffisamment chaude pour qu’elle soit encore à l’état liquide, mais elle doit être suffisamment fraîche pour être tenue à la main. Si vous ne pouvez pas tenir confortablement la bouteille, la solution est trop chaude et tuera les cellules Sf9. Confirmez que la solution Grace’s Insect Media w/ 10% FBS est à 42°C. Si c’est le cas, ajoutez un volume égal à la solution d’agarose pour compléter la solution finale d’agar. Mélangez bien la solution finale d’agar.
2. Une fois que la solution est prête, placez-la dans un bécher en verre rempli d’eau provenant du bain-marie. Cela devrait empêcher la solution de se solidifier pendant que vous l’utilisez sous la hotte. Pendant la procédure, vérifiez périodiquement la température de l’eau dans le bécher. Si elle commence à refroidir, remplacez-la par de l’eau chaude provenant du bain-marie.
3. Travaillant avec une paire de duplicata à la fois, aspirez soigneusement le milieu des cellules à l’aide d’un embout de pipette stérile de 200 µl et d’un aspirateur. Ne pas perturber le feuillet cellulaire. Tout en aspirant, inclinez légèrement la plaque et aspirez le surnageant par le bord de la plaque. Cela permettra une aspiration optimale sans perturber le feuillet cellulaire. Ensuite, ajoutez lentement 4 ml de solution d’agar à chaque plaque et laissez l’agar se solidifier.
4. Une fois que l’agar sur toutes les plaques s’est solidifié, placez soigneusement les plaques dans une chambre d’incubation propre et hermétique. Humidifiez la chambre en plaçant une gaze stérile et 10 ml d’eau stérile dans une boîte de culture de 10 mm sur la grille inférieure de la chambre d’incubation. Sceller la chambre et la placer dans un incubateur à 27°C. Laissez les plaques incuber pendant 6 à 10 jours.
5. Les plaques peuvent être visualisées en inversant les plaques sur un fond sombre et en les éclairant avec une source lumineuse puissante depuis le côté de la plaque, ou en les tenant à un angle de 45° dans une source lumineuse. Lorsque vous apprenez à identifier une plaque, entourez les plaques possibles avec un marqueur. À l’aide du microscope optique, visualisez à faible puissance pour confirmer la présence d’une zone de dégagement dans la pelouse de cellules. Visualisez à haute puissance pour rechercher des cellules infectées à la périphérie de la clairière, puis des cellules moins infectées à mesure que vous vous éloignez de la zone de clairière.
6. Pour faciliter la visualisation des plaques, superposez avec 3 ml d’agarose à 0,5 % (préparé comme décrit précédemment) contenant 50 µg/ml de rouge neutre. (Préparez la solution mère de rouge neutre (Sigma N7005) à 1 mg/ml dans de l’eau ou du PBS. Stériliser par filtration et conserver à 4°C dans l’obscurité). Laisser durcir et incuber la plaque pendant une nuit à 27°C. Le rouge neutre colorera les cellules saines et les plaques apparaîtront comme des zones claires, d’environ 0,5 à 3 mm de diamètre sur un fond blanc. Comme le rouge neutre est un colorant vital, il est important de colorer pendant que la monocouche cellulaire est saine, c’est-à-dire 4 à 7 jours après l’infection.

Purification des plaques à partir du stock viral

Pour assurer une bonne isolation, il est préférable que les plaques soient prélevées sur des plaques contenant moins de 50 plaques. Placer plusieurs dilutions du virus pour s’assurer d’obtenir un nombre suffisamment faible de plaques. Les plaques peuvent être prélevées à l’aide de pointes de micropipettes stériles (1 000 µl) ou de tubes microcapillaires.

Amplifier le virus à partir du prélèvement de plaques

1. Marquer la plaque sous la plaque avec un marqueur. À l’aide d’un embout de pipette stérile, retirez un bouchon d’agarose directement sur la plaque. Prélevez entre 10 et 100 plaques de cette manière.
2. Placez chaque bouchon d’agarose dans un tube de microcentrifugation séparé contenant 1 ml de milieu de culture tissulaire. Éluer les particules virales de l’agarose en faisant tourner le tube pendant une nuit à 4°C.
3. Ajouter 200 µl de chaque prélèvement de plaque dans des puits séparés d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits ensemencée avec 2 x 10 5 cellules par puits dans 1 ml de milieu TNM-FH frais. Incuber les plaques pendant 3 jours à 27°C.
4. Le surnageant viral de ce stock de passage un peut être recueilli et centrifugé pendant 5 min à 1 000 x g à 4°C pour éliminer les débris. Conserver à 4°C.
5. Ensemencer une plaque de culture tissulaire de 100 mm avec 5 x 10 6 cellules pour chaque isolat de plaque. Laisser les cellules se fixer et remplacer le milieu par 10 ml de milieu TNM-FH frais.
6. Ajouter 200 µl du stock de passage-un à la plaque de 100 mm et incuber à 27°C pendant 4 jours. Conservez les 800 µl de stock de passage-un restants à 4°C comme réserve.
7. Récoltez le surnageant viral et centrifugez pour éliminer les débris. Déterminer le titre de ce stock de passage-deux. Si le titre reste inférieur à 2 x 10 8 pfu/ml, passer à l’amplification du baculovirus.