Effets différentiels sur la perméabilité membranaire et la viabilité des cellules kératinocytaires humaines soumises à des champs mégasoniques de très faible intensité

L’effet de l’exposition à des US de très faible intensité (Ispta entre 7 et 16 mW/cm2, bien en dessous du seuil de cavitation, 100 mW/cm2) avec une fréquence de 1 MHz a été étudié sur des cellules HaCaT. Les expériences ont été réalisées à l’aide d’une installation médicale équivalente décrite dans la figure S1 de l’ESI, en faisant varier les paramètres de traitement, tels que l’Ispta, le cycle de travail et le temps de sonication. Les expériences préliminaires ont montré que, dans la gamme des paramètres d’exposition concernés ici, la température est restée constante (à 1 °C près), sans compter la dissipation thermique de l’énergie US. De plus, les traitements n’ont pas montré de dépendance significative des effets étudiés par rapport au rapport cyclique des ondes US. Ces observations sont cohérentes avec la faible absorption des US à 1 MHz ; au contraire, les effets thermiques et le rapport cyclique pourraient affecter les cellules et les tissus exposés à des fréquences plus élevées, le coefficient d’atténuation des US étant proportionnel à la fréquence23,31.

Les résultats seront d’abord présentés en considérant les deux paramètres d’exposition pertinents, le temps de sonication et l’Ispta, séparément. Les altérations structurelles et physiques de la membrane cellulaire (perméabilité, efficacité d’absorption et taille maximale des molécules internalisées) seront analysées et corrélées aux dommages cytotoxiques correspondants et à l’activation éventuelle de schémas inflammatoires. Ensuite, les résultats seront interprétés en termes de dose de sonication, définie comme le produit de l’Ispta par le temps d’exposition, c’est-à-dire la densité surfacique de l’énergie acoustique incidente sur l’échantillon pendant la sonication. En fait, les phénomènes étudiés dépendent de cette quantité et cela nous a permis d’identifier une gamme de paramètres d’exposition où un SP transitoire se produit avec des dommages biologiques négligeables.

Analyse de l’influence du temps d’exposition aux US

Les altérations de la perméabilité membranaire des cellules HaCaT induites par des US de 1 MHz de faible intensité ont été estimées en termes d’efficacité d’absorption de la sonde fluorescente verte calcéine. Comme les membranes intactes sont imperméables à la calcéine, celle-ci représente un marqueur fiable de la PS. Le pourcentage de cellules positives au vert a été quantifié par des analyses de cytométrie en flux selon la section 2.5.

Afin d’évaluer la sensibilité de la perméabilité membranaire au temps d’exposition aux US, une très faible Ispta US a été utilisée. Notamment, déjà un Ispta de 7 ± 1 mW/cm2 des effets significatifs sur la perméabilité de la membrane peuvent être déclenchés par des temps d’exposition appropriés. Les résultats représentatifs de l’enquête de cytométrie en flux parallèle sur les cellules HaCaT et NIH-3T3, toutes deux soniquées à Ispta ~7 mW/cm2 pendant 5′, 15′, 30′ et 45′ sont présentés dans la figure 1 (triangles rouges et carrés bleus, respectivement). Comme prévu, la comparaison entre les lignées cellulaires après de faibles temps de sonication (en dessous du seuil de sonoporation) se traduit par une faible affinité de la calcéine, où les différences (les plus élevées dans les cellules HaCaT) devraient s’expliquer par leurs caractéristiques respectives de composition et de perméabilité membranaires. Plus important encore, les deux lignées cellulaires montrent une augmentation significative de l’efficacité d’absorption à partir de 15′ d’exposition, ce qui correspond à une dose de sonication de (6,3 ± 0,9) J/cm2, suggérant l’activation du processus de SP. Selon les meilleurs ajustements de la figure 1, pour des temps d’exposition plus longs, nos expériences mettent en évidence une corrélation linéaire entre l’efficacité d’absorption et le temps d’exposition, avec un taux d’absorption identique induit par les US dans les cellules HaCaT et NIH-3T3 (pentes de régression linéaire (%/min) 1,3 ± 0,2, et 1,4 ± 0,2, pour HaCaT et NIH-3T3, respectivement). Cela signifierait que l’augmentation de l’efficacité d’absorption due au SP est un phénomène indépendant de la lignée cellulaire.

Pour approfondir le processus de SP et caractériser l’internalisation, les cellules HaCaT traitées ont été évaluées par microscopie à fluorescence. Conformément aux résultats de la cytométrie en flux, les échantillons soniqués pendant 5′ ne montrent pas d’altération significative de la perméabilité membranaire par rapport à l’échantillon témoin (non traité), tandis qu’à partir de 15′, une efficacité d’absorption croissante est observée (comme le montrent la figure 2 et la figure S2 de l’ESI), bien que toutes les cellules n’aient pas montré de fluorescence. De manière correspondante, les cellules apparaissent moins denses et adhérentes par rapport à l’échantillon témoin, ce qui suggère un relâchement des jonctions serrées. Les images représentatives de la figure 2 suggèrent une localisation hétérogène de la calcéine dans les cellules, et en fait, la microscopie confocale à fluorescence a permis de distinguer clairement dans les cellules HaCaT la distribution périphérique de la sonde de la distribution interne (voir image et reconstructions 3D de la figure 3). Des images plus détaillées sont présentées dans la section 3 de l’ESI. Les observations sont cohérentes avec une absorption de la sonde fluorée à deux niveaux : un niveau périphérique, où la sonde est localisée dans le réseau du réticulum endoplasmique autour de la membrane plasmique ; l’autre niveau, présenté de manière significative après une exposition de 30′, où la diffusion de la sonde dans le cytoplasme provoque une fluorescence intense distribuée uniformément dans toute la cellule, y compris le nucléoplasme. Il convient de noter que le diamètre de Stokes de la calcéine est ~1,36 nm et son transport intranucléaire n’est pas entravé par des barrières diffusives29. Une analyse plus complète rapportée dans les sections 3.2 et 3.3 permet de conclure que la dose d’exposition aux US et le poids moléculaire de la sonde étaient des facteurs dominants pour déterminer l’absorption.

Un autre test basé sur la fluorosonde rouge PI a été réalisé pour évaluer la récupération de la perméabilité de la membrane native des cellules soniquées (voir également la section 2.3). L’internalisation de l’IP indique l’activation des processus cytotoxiques. La co-localisation des colorants vert et rouge à l’intérieur des cellules indique donc l’échec du processus de récupération de la membrane après SP. D’autre part, l’observation de la fluorescence verte dans les cellules en l’absence de la fluorescence rouge indique l’apparition d’un SP membranaire pendant le traitement US et sa récupération réussie après l’arrêt du champ. Des images confocales de fluorescence représentatives sont présentées dans la figure 4. La co-localisation des deux colorants est absente dans les cellules traitées pendant 15′, alors qu’elle est à peine observée après 30′ d’exposition (Figure S5 de ESI). De manière cohérente, une perte nette de viabilité de ~5% a été révélée, vérifiée par cytométrie de flux. Dans les cellules soniquées pendant 45′, ce qui correspond à une dose de (19 ± 3) J/cm2, la co-localisation apparaît plus évidente (voir les flèches blanches dans la Fig. 4B) et une perte de viabilité plus significative se produit (~10%, comme vérifié par cytométrie en flux). Ces résultats suggèrent qu’un temps d’exposition plus long, correspondant à une dose plus élevée à Ispta fixe, induit une altération irréversible de la structure membranaire suivie d’une réponse cytotoxique conséquente.

Analyse de l’influence de l’intensité des US

L’effet de la variation de l’intensité du champ US appliqué sur la perméabilité membranaire a été analysé sur la lignée cellulaire HaCaT après 15′ d’exposition, suffisamment courte pour exclure les effets induits par une sonication de longue durée. Dans notre étude, les intensités des US se situaient entre Ispta = (7 ± 1) mW/cm2 et Ispta = (16 ± 1) mW/cm2, bien en dessous du seuil de cavitation24. Selon le protocole décrit dans les sections 2.3 et 2.5, des dextrans marqués au FITC de différents MW (MW = 10, 40 et 70 kDa) ont été utilisés pour caractériser, pour chaque intensité US, l’induction de la perméabilité membranaire aux différentes tailles de molécules. Cette procédure permet à son tour d’évaluer la taille du sonopore. De même que la calcéine, les dextrans ne pénètrent pas de manière significative dans les cellules non traitées31,32, alors que dans le régime de cavitation US, l’absorption cellulaire des dextrans marqués au FITC peut être fortement augmentée à la fois par la SP et par la promotion du trafic des endosomes30. À cet égard, les résultats des mesures de cytométrie de flux rapportés dans la figure 5 montrent clairement une absorption dépendante de la taille, un phénomène qui nous permet d’exclure la concomitance d’effets d’endocytose active et, selon la littérature22, suggère la SP déclenchée par une faible intensité comme principal mécanisme impliqué dans le transport des molécules de dextran à travers la membrane plasmique. Plus précisément, l’absorption observée induite par la SP est caractérisée par un seuil Ispta, augmentant linéairement avec l’augmentation du MW des molécules internalisées. En dessous de ce seuil, l’efficacité de l’absorption des cellules traitées est comparable à celle des cellules non exposées. Les valeurs du seuil Ispta sont indiquées dans le tableau 1. Pour des intensités supérieures au seuil, l’efficacité d’absorption augmente avec l’augmentation de l’Ispta jusqu’à atteindre un maximum. Pour le dextran 10 kDa, elle diminue ensuite légèrement jusqu’à un plateau. La diminution observée de l’efficacité de l’absorption à des intensités élevées peut être expliquée par l’augmentation du nombre de cellules mortes, qui sont éliminées de l’échantillon lors du rinçage et ne contribuent donc pas aux analyses de cytométrie en flux. En outre, l’activation des processus apoptotiques pourrait entraver l’internalisation du colorant. Notamment, pour Ispta = 15 mW/cm2 bien que cette valeur soit très inférieure au seuil de cavitation, les cellules sont capables d’internaliser des dextrans de 70 kDa, avec un diamètre de Stokes de ~12 nm. Cette valeur peut être considérée comme une estimation de la taille minimale des sonopores produits dans la membrane. Dans la figure S6 (section 4 de ESI) est rapporté un ensemble d’images de fluorescence représentatives montrant l’absorption dextrans au seuil Ispta ainsi que le test PI.

L’internalisation de PI met en évidence une réponse cytotoxique significative à Ispta = 15 mW/cm2 (dose d’exposition 13,5 J/cm2). Comme l’ont signalé Udroiu et al.13 dans des conditions expérimentales similaires, une augmentation légère mais significative de l’incidence des micronoyaux a également été observée dans les cellules NIH-3T3, en fonction de l’intensité et du temps d’exposition aux US de 1 MHz. Ces observations ont suggéré que d’autres études étaient nécessaires pour mieux comprendre les bioeffets accompagnant les PS membranaires, et c’est pourquoi une étude de la réponse biologique des cellules soniquées en fonction de l’intensité des US a été réalisée.

La réponse biologique aux « blessures membranaires » induites par les PS à très faible intensité a été caractérisée de manière approfondie en évaluant la mort cellulaire, à l’aide du test combiné AnnexinV et PI décrit dans la section 2.5 (voir également la section 5 de l’ESI). Nous avons également évalué l’expression du gène IL-6, une cytokine reliant l’inflammation chronique au cancer33,34. Les résultats de l’analyse par cytométrie de flux, exprimés en termes de pourcentage de cellules, sont rapportés dans la Fig. 6. La viabilité cellulaire est principalement préservée (>90%) pendant les traitements 15′, néanmoins, à partir de Ispta = 9 mW/cm2 une légère diminution se produit, accompagnée d’une augmentation des cellules apoptotiques précoces. À Ispta = 14 mW/cm2, un pourcentage significatif de cellules nécrotiques commence à être observé, tandis qu’à Ispta = 16 mW/cm2, l’apoptose tardive contribue également à la mort cellulaire, en correspondance d’une légère réduction de la nécrose (graphiques représentatifs des points de cytométrie de flux dans la Figure S7 de l’ESI). L’expression du gène IL-6 a été déterminée par RT-PCR (figure 7). Aucune régulation ascendante n’a été observée pour Ispta ≤15 mW/cm2 alors que le traitement à 16 mW/cm2 a induit une surexpression de ce gène par rapport à celui des cellules non traitées.

Ces résultats suggèrent que, à partir d’un seuil Ispta de 16 mW/cm2 et de 15′ de sonication, les dommages membranaires causés par les US non seulement diminuent la viabilité cellulaire mais aussi, par la surexpression du gène IL-6 lié à l’inflammation, pourraient induire une réponse inflammatoire. Puisque plusieurs recherches ont reconnu un rôle de l’inflammation dans la promotion de la pathogenèse et la progression de maladies telles que le cancer35,36, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour mieux caractériser les aspects liés aux modèles inflammatoires.

Analyse de l’influence de la dose de sonication

Pour analyser quantitativement la relation entre le champ US appliqué et les effets biologiques observés en termes d’énergie délivrée aux cellules pendant l’exposition, la dose de sonication a été calculée pour chaque traitement comme le produit de l’intensité Ispta par le temps d’exposition. Les valeurs obtenues sont reportées dans le tableau 2, où les effets biologiques observés sont identifiés par des couleurs de fond. Nos résultats suggèrent que la SP de la membrane se produit à partir d’une dose seuil d’environ 6,3 J/cm2. De plus, la taille des sonopores peut être liée à la dose de sonication. Pour des doses supérieures à 10,8 J/cm2, une diminution de la viabilité et des événements concomitants d’apoptose précoce sont observés dans la cellule traitée, suivis à partir de 14,4 J/cm2 par une apoptose tardive, une nécrose et une surexpression de l’IL-6.

Nous soulignons que cette dose, et Ispta 16 mW/cm2, correspond à un pic de pression négative de ~0,02 MPa. Cette valeur semble suffisamment élevée pour induire un stress mécanique à l’interface membrane plasmique/eau, bien qu’elle soit inférieure d’un ordre de grandeur à la valeur du seuil d’exposition de sécurité suggérée jusqu’à présent (indice mécanique ~0,2-0,3, à 1 MHz).

Notons que nos expériences ont été comparées avec succès à celles réalisées à l’aide d’un système électromédical réellement employé dans la thérapie par US (voir également la section 2.2), soulignant ainsi la pertinence médicale de notre approche. À cet égard, nous sommes convaincus que la fourniture d’informations sur la dose de sonication (à la fréquence US fixe) permet un indice plus complet de caractérisation de la réponse cellulaire à l’exposition aux US et, à son tour, une identification fine d’une gamme de paramètres où le SP transitoire se produit avec des dommages biologiques négligeables.

Une étape très importante pour comprendre l’impact biologique in vivo de nos résultats serait d’opérer des expositions aux US sur des biosystèmes tridimensionnels, tels que des tissus humains composés de chératinocytes empilés ou de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique.