Dépistage immunologique de la diphénhydramine (Benadryl®) dans l’urine et le sang. Using a Newly Developed Assay

Abstract

La diphénhydramine (DPH) est un antihistaminique commun en vente libre qui produit de la somnolence et a le potentiel de causer des accidents liés à la conduite sous l’influence de drogues-.sous l’influence de drogues. À ce jour, il n’existe aucun kit de dépistage par immunodosage disponible dans le commerce pour sa détection dans les fluides biologiques tels que l’urine et/ou le sang. Nous décrivons un nouveau test immuno-enzymatique (ELISA) de dépistage et faisons état de son utilité dans l’analyse d’échantillons authentiques prélevés sur des volontaires. Le test est spécifique pour la détection de la DPH et ne détecte pas les antihistaminiques étroitement apparentés comme la bromphéniramine, la chlorphéniramine et la doxylamine. On observe un degré variable de réactivité croisée avec certains composés tricycliques, en raison des similitudes de structure de la chaîne latérale avec la DPH. La précision intra et inter journalière du test a été déterminée comme étant inférieure à 10%. Le test est très sensible et a une plage de travail de 1 à 500 ng/mL pour l’urine et de 1 à 250 ng/mL pour le sang. Le dosage a été validé plus avant avec des échantillons d’urine et de sang authentiques obtenus auprès de volontaires et de laboratoires de coroners.

Introduction

La diphénhydramine (DPH), 2-diphénylméthoxy-N,N-diméthyléthanamine, est un antihistaminique à base d’éthanolamine. Elle a été l’un des premiers agents antihistaminiques découverts en 1946 et est largement utilisée pour soulager les symptômes d’allergie courants. La DPH exerce son action en bloquant les effets de l’histamine au niveau des récepteurs H1. Elle est également un inhibiteur du CYP2D6 et un dépresseur du système nerveux central (SNC). En plus d’être un antihistaminique, elle est également utilisée comme antiémétique, antitussif et sédatif. Bien qu’efficace, la DPH a plusieurs effets secondaires, dont la somnolence, les troubles moteurs, l’accélération du rythme cardiaque, la vision trouble et autres (1, 2), de sorte qu’elle a été signalée comme un facteur de risque dans les situations de conduite dangereuse (3-5). Les interactions de la DPH avec d’autres médicaments et/ou l’alcool, pourraient encore augmenter le risque d’accidents et de décès liés à la conduite.

Les antihistaminiques sont largement classés en antihistaminiques de première génération, de deuxième génération et sur ordonnance. Les antihistaminiques de première génération, qui comprennent la DPH (Benadryl™), sont tous en vente libre et provoquent une somnolence marquée. Les antihistaminiques apparentés de cette classe sont la chlorphéniramine (Singlet™), la bromphéniramine (Dimetapp™) et la doxylamine (Vicks NyQuil™). Un autre antihistaminique de première génération est le sel 8-chlorotheophyllinate de DPH, connu sous le nom de dimenhydrinate (Dramamine™), qui est prescrit pour le mal des transports. Les antihistaminiques de deuxième génération comprennent la loratadine (Claritin™), la desloratadine (Clarinex™), l’acrivastine (Semprex-D™), l’ébastine (Kestine™), la cétirizine (Zyrtec™) et la fexofénadine (Allegra™), qui sont des alternatives non somnolentes à la DPH. La figure 1 présente les structures chimiques des antihistaminiques couramment rencontrés.

Les effets somnifères de la DPH ont entraîné son association avec d’autres médicaments comme l’acétaminophène, dans des formulations comme le Tylenol PM™, ou avec des décongestionnants nasaux comme la pseudoéphédrine. Même si la DPH est l’un des plus anciens antihistaminiques, elle est facilement disponible en vente libre et est plus efficace et rapide que certains des médicaments les plus récents délivrés sur ordonnance, d’où son utilisation répandue (6). L’étiquette d’avertissement du Benadryl indique clairement le danger de conduire après avoir pris le médicament. De plus, de nombreuses études ont clairement démontré une altération des capacités motrices et des performances cognitives associées à la tâche complexe de la conduite automobile après la prise de DPH par rapport à un antihistaminique de deuxième génération ou même à l’alcool (7-12). Une étude a également été réalisée sur le risque accru de blessure après la prise de DPH par rapport aux antihistaminiques de deuxième génération (13). Ces études rationaliseraient clairement l’importance de tester principalement la DPH.

La DPH est disponible sous plusieurs formes de dosage, notamment liquide, comprimés, capsules, gommes à mâcher et crèmes topiques. La posologie suggérée pour les adultes est de l’ordre de 25-50 mg toutes les 4-6 h, sans dépasser 50-100 mg (1). Lorsque la DPH est prise, elle est rapidement absorbée par l’organisme, l’activité maximale étant observée environ 1 h après la prise du médicament. La demi-vie de la DPH est d’environ 2-9 h, les concentrations plasmatiques maximales étant atteintes après environ 1-4 h après la prise de la dose. Après l’administration d’une dose orale unique de 50 mg, des concentrations plasmatiques maximales moyennes de 83 ng/mL de diphénhydramine ont été détectées après 3 heures, puis ont diminué à 9 ng/mL après 24 heures (14). Une dose unique de 100 mg de DPH administrée par voie orale a entraîné des concentrations plasmatiques maximales moyennes de 112 ng/mL 2 heures après la dose (15). L’efficacité des antihistaminiques est observée à des concentrations supérieures à 25 ng/mL, la somnolence peut être observée à 30-40 ng/mL et des troubles mentaux sont observés avec des concentrations supérieures à 60 ng/mL (16). Il a été rapporté que les niveaux thérapeutiques de DPH dans le sang se situent entre 25 et 112 ng/mL, que les niveaux toxiques sont d’environ 5000 ng/mL et que les niveaux létaux dépassent 8000 ng/mL (3, 17). Plusieurs cas d’abus de DPH ont également été documentés pendant de nombreuses années (18-20).

Le métabolisme in vivo de la DPH entraîne la conversion d’environ 30 % de la dose en métabolite N-desméthyle, suivie de la formation du métabolite N,N-didesméthyle et de 13 % de la dose convertie en métabolites acétyles par l’intermédiaire de l’amine. Un petit pourcentage est converti en acide diphénylméthoxyacétique, et le pourcentage majeur restant de la dose est excrété sous forme inchangée comme le médicament mère (21, 22). Le métabolisme de la diphénhydramine est décrit dans la figure 2.

Les méthodes traditionnelles de recherche de la DPH dans le plasma humain ont impliqué une extraction des échantillons coûteuse et longue suivie de procédures de confirmation. Plusieurs groupes ont rapporté l’utilisation de diverses méthodes de chromatographie en phase gazeuse (GC) pour la détection de la DPH dans le plasma et l’urine (23-27). Des rapports ont également été rédigés sur des méthodes d’électrophorèse capillaire (28) et de chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) (29) qui ont été développées pour la détection de la DPH. Jusqu’à présent, il n’existe aucun rapport dans la littérature sur le dépistage de la diphénhydramine par ELISA ou toute autre méthode d’immunodosage. Dans cette publication, nous présentons la première méthode de dépistage ELISA de la DPH dans l’urine et le sang humains.

Il est considéré comme une pratique standard dans les laboratoires de toxicologie de réaliser un dépistage par immunodosage, dans lequel les échantillons positifs sont d’abord identifiés puis confirmés par des techniques de GC-MS ou LC-MS. La plupart des laboratoires de toxicologie ont recours à cette stratégie « coût-bénéfice », par opposition à la réalisation d’une procédure de confirmation plus coûteuse pour chaque échantillon reçu. Il serait donc utile de disposer d’une méthode de dépistage ELISA fiable, applicable aux échantillons DPH liés aux accidents de la route et aux décès. À cette fin, les toxicologues ont formulé des recommandations pour l’identification des conducteurs en état d’ivresse, notamment une proposition de seuil de 25 ng/ml dans le sang et de 50 ng/ml dans l’urine (30). Cet article décrit une méthode de dépistage ELISA robuste et précise de la DPH dans l’urine et le sang humains, suivant ces directives proposées.

Expérimental

Matériaux

Réactifs et produits chimiques. La diphénhydramine a été obtenue auprès de Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), et la diphénhydramine-d3 (solution de 100 μg/mL dans le méthanol) a été obtenue auprès de Cerilliant (Round Rock, TX). L’anticorps polyclonal spécifique de la DPH a été élevé par Immunalysis (Pomona, CA), et les haptènes de la DPH et les conjugués marqués à la peroxydase de raifort ont été synthétisés chez Immunalysis. Le réactif substrat 3,3′,5,5′-tétraméthylbenzidine (TMB) utilisé pour la réaction colorimétrique a été obtenu auprès de Pierce (Rockford, IL). Les enzymes utilisées dans le processus étaient la thyroglobuline bovine (BTG) obtenue de Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), la peroxydase de raifort (HRP) obtenue de BBI Enzymes (Madison, WI) et l’albumine de sérum bovin (BSA) obtenue de Proliant Biologicals (Boone, IA). Tous les solvants utilisés étaient de qualité HPLC, et tous les produits chimiques étaient de qualité ACS et ont été obtenus auprès de Spectrum Chemicals (Gardena, CA). Pour le test ELISA, les calibrateurs élevés pour la DPH à 1000 ng/mL ont été préparés dans de l’urine négative synthétique et du sang négatif synthétique et stockés à 4°C. L’urine négative synthétique et le sang négatif synthétique utilisés dans ce test ont été formulés avec des ingrédients présents dans ces matrices respectives et correspondent aux réponses immunologiques de trois échantillons d’urine et de sang humains négatifs (31, 32). L’urine négative synthétique est constituée d’une solution de BSA à 0,1 % dans de l’eau désionisée ; avec 0,2 % de colorant FD&C jaune #6, et le sang négatif synthétique est constitué d’une formulation exclusive d’Immunalysis.

Appareil. Les colonnes d’affinité HiTrap protein G HP qui ont été utilisées pour la purification de l’immunoglobuline G (IgG) ont été achetées auprès de GE Healthcare (Pittsburgh, PA). Des plaques de microtitration standard en polystyrène (96 puits) ont été obtenues auprès de Corning Costar (Corning, NY). Un laveur de plaques de microtitration Tecan Columbus Pro et un lecteur de plaques Tecan Sunrise ont été obtenus auprès de Tecan (San Jose, CA). Les pipettes utilisées au cours du processus de développement de l’essai immunologique ont toutes été obtenues auprès de Rainin Instruments (Oakland, CA). Un spectromètre de masse à triple quadripôle 6410 et la colonne Zorbax Eclipse XDB C18 utilisés pour l’analyse LC-MS-MS ont tous deux été achetés auprès d’Agilent Technologies (Santa Clara, CA).

Méthodes

ELISA. L’étape primaire dans le développement de la méthode ELISA a consisté à générer des anticorps polyclonaux qui étaient basés sur la réponse immunochimique d’une espèce animale sélectionnée à un antigène spécifique de la DPH. À cette fin, des lapins ont d’abord été immunisés avec un antigène de la DPH consistant en une DPH conjuguée à une thyroglobuline bovine (BTG). Le processus d’immunisation et de saignée des lapins a été confié à une animalerie spécialisée. Le sérum obtenu des lapins a été purifié en interne par chromatographie d’affinité par élution à travers des colonnes de protéine G, afin d’obtenir la fraction IgG purifiée. L’IgG polyclonale spécifique de la DPH a ensuite été immobilisée sur des plaques de microtitration en polystyrène à 96 puits. L’anticorps en excès a été aspiré, les sites de liaison libres de l’anticorps ont été bloqués avec une solution de tréhalose à 1 % dans l’eau et les plaques ont ensuite été séchées dans une étuve sous vide à 37 °C pendant une nuit. Les plaques ont ensuite été conservées dans une pochette scellée avec un dessiccant, car il est essentiel de les garder à l’abri de l’humidité. Une courbe dose-réponse d’urine de DPH a d’abord été préparée en fortifiant de l’urine synthétique négative à 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250 et 500 ng/mL à partir de la solution mère de calibrateur élevé du médicament. La courbe de sang a été obtenue en fortifiant du sang synthétique négatif à 1, 5, 10, 25, 50, 100 et 250 ng/mL à partir de la solution de calibrateurs élevés. Ces calibrateurs dans le sang synthétique ont ensuite été dilués à 1:10 avec un tampon phosphate 100 mM contenant 150 mM de chlorure de sodium (phosphate buffered saline, pH 7,0) avant d’être analysés. Tous les échantillons de sang ont été dilués de la même manière à 1/10 avec une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,0). Les échantillons d’urine ont également été dilués au 1:20 avec une solution saline tamponnée au phosphate 100 mM (pH 7,0). Les calibrateurs et les échantillons ont ensuite été pipetés en double dans les puits de la plaque de microtitration, en utilisant une taille d’échantillon de 10-μL pour l’urine ainsi que pour le sang. Cette opération a été suivie de l’ajout de 100 μL de conjugué enzymatique constitué de diphénhydramine marquée à la HRP. La plaque a ensuite été laissée à incuber pendant 1 h dans l’obscurité, à température ambiante. Les puits ont ensuite été lavés six fois avec 350 μL d’eau désionisée à l’aide d’un laveur de plaques de microtitration, aspirés pour éliminer l’eau, puis inversés et giflés pour éliminer toute eau résiduelle des puits. Le substrat chromogène TMB (100 μL) a ensuite été ajouté à chaque puits et la plaque a été incubée pendant 30 min supplémentaires dans l’obscurité. La réaction a ensuite été arrêtée avec 100 μL d’acide chlorhydrique 1 N, pour produire une couleur jaune. Le dosage est colorimétrique et l’absorbance a été lue à une double longueur d’onde de 450 nm et 650 nm à l’aide d’un lecteur de plaques de microtitration. La longueur d’onde de 650 nm mesure l’absorbance de fond, que le lecteur de plaques soustrait ensuite de l’absorbance finale. L’intensité de la couleur produite est inversement proportionnelle à la concentration de l’analyte dans l’échantillon.

LC-MS-MS. Une pompe LC série 1200 couplée à un MS triple-quadripôle 6410 fonctionnant en mode d’ionisation positive par électrospray (ESI) a été utilisée pour l’analyse. La colonne LC-MS-MS utilisée était une colonne Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 × 50 mm × 1,8 µm). L’échantillon à analyser a été préparé comme suit : un échantillon d’urine de 100 µl contenant 50 µl de diphénhydramine-d3 (200 ng/ml) a été ajouté à un flacon pour échantillonneur automatique. Les échantillons ont été directement injectés dans le LC-MS-MS via un autoinjecteur. La température de la colonne a été maintenue à 60°C, et le volume d’injection était de 5 µL. La phase mobile était composée d’acide acétique à 0,2% pH 4 (solvant A) et de méthanol (solvant B). Initialement, la composition de la phase mobile était de 100% A à un débit de 0,7 mL/min sur une période de 6 min, puis le pourcentage de méthanol a été augmenté à 100%, puis est revenu à nouveau à 100% A après 7 min.

La température du gaz était de 350°C, le débit de gaz était de 10 L/min, et la pression du nébuliseur était maintenue à 50 psi. L’azote a été utilisé comme gaz de collision, et la tension capillaire était de 4000V. Deux transitions ont été sélectionnées et optimisées pour chaque médicament. Le temps de séjour était de 50 ms, et l’énergie optimale du fragmenteur était de 80V pour toutes les transitions. Les tensions d’énergie de collision optimales ont été déterminées comme étant 35V pour l’étalon interne deutéré (diphenhydramine-d3), 15V pour la transition primaire et 30V pour la transition secondaire pour la diphenhydramine elle-même. Le rapport entre la transition qualificative et la transition quantificative a été déterminé à peu près au milieu de la gamme d’étalonnage : 100 ng/mL. La transition pour la diphénhydramine-d3 était de 259,7 > 165,2 ; la transition primaire (de quantification) pour la diphénhydramine était de 256,7 > 167,2 ; la transition de qualification (secondaire) était de 256,7 > 152,2. La diphénhydramine non marquée peut se décomposer en ions produits de m/z 167 ou 165 à partir de l’ion précurseur, selon l’énergie de collision appliquée. Notre procédure a été validée en utilisant les conditions décrites. La limite de détection (LOD) de la méthode LC-MS-MS était de 10 ng/mL et a été déterminée comme étant la plus faible concentration détectable avec un rapport signal/bruit > 2.

Résultats et discussion

Courbe dose-réponse

La méthode utilise une liaison compétitive entre le conjugué enzymatique et l’analyte libre dans l’échantillon pour une quantité fixe de sites de liaison des anticorps, proportionnelle à leur concentration dans le mélange. Les courbes dose-réponse pour la DPH ont été préparées dans de l’urine négative synthétique et du sang négatif synthétique aux concentrations décrites précédemment. B0 est l’absorbance du calibrateur négatif, et B représente l’absorbance des niveaux de calibrateurs individuels. Le rapport en pourcentage du calibrateur individuel au calibrateur négatif (B/B0) a été calculé pour chaque niveau de calibrateur et tracé en fonction de la concentration du médicament (ng/mL) pour l’urine et le sang (figure 3). Les valeurs de B/B0 sont inversement proportionnelles à la concentration de médicament dans l’échantillon, la raison étant que plus la concentration de médicament est élevée, moins le conjugué médicament-enzyme se lie à l’anticorps, produisant ainsi une valeur d’absorbance plus faible.

LOD et seuil de coupure

La LOD du dosage de la DPH a été déterminée comme étant la concentration la plus faible qui peut être mesurée avec précision en utilisant les paramètres décrits pour le dosage. Trois échantillons d’urine authentique sans médicament ont été fortifiés avec des concentrations variables de DPH jusqu’à 1 ng/mL, puis analysés en double. La valeur la plus faible calculée à partir de deux écarts-types a été obtenue et, sur la base de ce résultat, la LOD du test a été déterminée comme étant de 1 ng/mL. Les concentrations seuils ont été conçues pour être de 50 ng/mL pour l’urine et de 25 ng/mL pour le sang. Ces deux valeurs ont été établies comme les points de décision optimaux sur la base de deux écarts types des calibrateurs à la partie linéaire de la courbe dose-réponse, ainsi qu’en gardant à l’esprit les directives recommandées établies par le domaine de la toxicologie.

Sélectivité

L’interférence des composés apparentés et non apparentés a été étudiée en dopant ces substances dans de l’urine négative synthétique et en les faisant passer dans le test ELISA. Le tableau I montre les données de réactivité croisée avec les composés étroitement apparentés à la diphénhydramine par leur structure et leur activité pharmacologique, qui se sont révélées égales ou inférieures à 1 % au seuil de 50 ng/mL. L’orphénadrine, qui est un relaxant musculaire ainsi qu’un agent antihistaminique, a présenté une réaction croisée avec le test à 42 % car elle a une structure très similaire à celle de la DPH, à l’exception d’un groupe substituant méthyle. Aucun des métabolites de la DPH présentés dans la figure 2 n’a été dépisté en tant que réactifs croisés dans ce test car ils n’étaient pas disponibles dans le commerce à l’époque.

Des composés non liés à la DPH ont également été analysés à des concentrations de 100 000 ng/mL dans le test. Le tableau II montre la réactivité croisée avec ces composés non apparentés. La plupart de ces composés n’ont pas interféré avec la détection de la DPH dans le test. En raison de similitudes dans la structure de la chaîne latérale, plusieurs composés comme l’amitriptyline, la chlorpromazine, la clomipramine, la doxépine, l’imipramine et la cyclobenzaprine ont montré des degrés variables de réactivité croisée avec le test. Les méthodes de confirmation permettraient de préférence d’exclure tout faux positif détecté par le test ELISA en raison de ces réactifs croisés qui pourraient interférer avec le test de la DPH. Les effets de matrice des échantillons d’urine et de sang authentiques exempts de DPH ont également été étudiés pour déterminer leurs effets sur le test. Aucun résultat faux-positif indésirable dû aux matrices d’urine et de sang n’a été observé lorsque des échantillons d’urine et de sang exempts de DPH confirmés par LC-MS-MS ont été criblés avec le test.

Précision

Les précisions intra-journalières et inter-journalières de l’ELISA ont été réalisées uniquement dans l’urine synthétique à des concentrations de 0, 5, 10, 25 et 50 ng/mL. La précision intra-journalière a été calculée comme coefficient de variation (CV%) à partir de 8 analyses effectuées le même jour (n = 8) et était inférieure à 10%, et la précision inter-journalière (CV%) calculée à partir de 8 analyses par jour sur 10 jours (n = 80) et s’est également avérée inférieure à 10%. Les données sont présentées dans le tableau III.

Stabilité et durée de conservation du test

La durée de conservation d’un produit peut être définie comme le temps pendant lequel les caractéristiques de performance essentielles sont maintenues dans des conditions de manipulation spécifiques (33). Afin de répondre à cette exigence pour les réactifs cliniques, une étude de stabilité accélérée a été réalisée pour déterminer la durée de conservation approximative du produit commercial. Le conjugué enzymatique DPH-HRP a été soumis à un stress à 37°C pendant une période de 14 jours. Pendant cette période, il a été analysé à intervalles réguliers et ses performances ont été comparées à celles du conjugué médicament-enzymatique réfrigéré conservé à 4°C. La courbe dose-réponse a été réalisée à des niveaux d’étalonnage de 10, 50 et 100 ng/ml dans de l’urine synthétique pendant la période de 14 jours. On a constaté que le dosage présentait une réponse dose-réponse presque identique sur l’ensemble de l’étude de 2 semaines de temps accéléré. Cette période de 14 jours d’essai en temps accéléré représente l’équivalent d’au moins 18 mois de stabilité en temps réel à 4°C (33). Les données sont présentées dans la figure 4.

Echantillons authentiques

Afin de valider le dosage, des échantillons d’urine ont été obtenus à différents moments sur une période d’une semaine chez cinq volontaires qui sont des utilisateurs thérapeutiques réguliers de diphénhydramine en raison de symptômes d’allergie communs. Les cinq volontaires ont été invités à remplir un questionnaire indiquant tous les médicaments qu’ils prenaient, et il a été noté qu’aucun autre médicament n’était mentionné. Vingt échantillons ont été recueillis et d’abord dépistés par ELISA, puis confirmés par LC-MS-MS. Tous les échantillons d’urine ont été prédilués au 1:20 avec une solution saline tamponnée au phosphate 100 mM (pH 7,0) avant d’effectuer le test ELISA. Six échantillons se sont révélés négatifs par les deux méthodes, tandis que 14 échantillons étaient positifs par ELISA, dont 1 a été confirmé comme négatif par LC-MS-MS. Cela pourrait s’expliquer par le fait que la quantité de DPH présente dans cet échantillon, telle que trouvée par LC-MS-MS, était proche du seuil de 50 ng/mL. Les échantillons d’urine positifs contenaient des niveaux de DPH compris entre 60 et 700 ng/mL. Dix échantillons d’urine de contrôle ont également été préparés en fortifiant de l’urine négative synthétique avec des concentrations positives faibles et élevées de diphénhydramine, puis analysés dans le cadre du test. Les résultats étaient tous positifs par ELISA et corrélés avec leurs données de confirmation par LC-MS-MS.

Des spécimens post-mortem ont été utilisés pour la validation du test sanguin. Vingt échantillons de sang post-mortem ont été obtenus auprès du laboratoire du coroner du comté de Los Angeles. Tous les échantillons de sang ont été pré-dilués au 1:10 avec une solution saline tamponnée au phosphate 100 mM (pH 7,0) avant l’analyse. Les 20 échantillons se sont révélés positifs par ELISA et ont été comparés à leurs données de confirmation GC-MS, également fournies par le laboratoire du coroner, qui ont montré qu’ils contenaient une large gamme de concentrations de DPH entre < 100 et 870 ng/mL. Bien qu’un échantillon ait confirmé une concentration inférieure à la limite de quantification GC-MS de 100 ng/mL, la DPH a quand même été identifiée en utilisant la procédure ELISA. Le but de cette étude était de valider la méthode ELISA avec une procédure de confirmation connue et non de tenter d’interpréter les concentrations. La conclusion de cette étude est que le test ELISA est capable de détecter des niveaux thérapeutiques de DPH, ainsi que des niveaux post-mortem beaucoup plus élevés, et pourrait donc être facilement utilisé à des fins de dépistage de DUID, ainsi que dans les cas de décès.

Conclusions

La DPH est un médicament en vente libre qui a été lié à de nombreux accidents liés à la conduite automobile ainsi qu’à des décès. Un test ELISA serait donc utile pour déterminer la présence de médicaments en vente libre comme les antihistaminiques dans les échantillons obtenus dans des situations liées à la conduite automobile. Cet article décrit le développement d’une méthode de dépistage ELISA hautement sensible et spécifique pour la diphénhydramine dans les matrices urinaires et sanguines avec une précision <10%. À la connaissance des auteurs, il s’agit de la première méthode de dosage immunologique développée pour la détection de la DPH dans les fluides corporels humains. Cette méthode suit les directives recommandées sur un seuil de 50 ng/mL dans l’urine et de 25 ng/mL dans le sang pour les cas de DUID. La validité de la méthode a également été vérifiée avec des échantillons d’urine et de sang authentiques, et les données ELISA ont été corrélées avec les résultats de confirmation LC-MS-MS et GC-MS. Même si certains des échantillons analysés provenaient de cas post-mortem, les résultats obtenus, combinés à la faible limite de détection du test, démontrent clairement l’applicabilité du test aux cas d’affaiblissement des facultés sur la route, où de plus faibles quantités de DPH peuvent être détectées. Un certain degré de réactivité croisée a été observé avec certains composés tricycliques dont la structure est similaire à celle de la DPH ; toutefois, tout faux positif résultant de ces composés serait éliminé au stade de la confirmation. D’autres études doivent être menées pour éliminer les problèmes de réactivité croisée avec les composés tricycliques et améliorer celle avec des antihistaminiques similaires.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par un financement de Immunalysis Corporation. Nous tenons à remercier le Dr James Soares et M. Michael Vincent pour leurs discussions perspicaces pendant la préparation de ce manuscrit, Mme Cynthia Coulter pour l’analyse LC-MS-MS des échantillons d’urine, et M. Dan Anderson au laboratoire du coroner du comté de LA pour avoir fourni des échantillons de sang positifs. Nous souhaitons également remercier tous les volontaires qui ont fourni des échantillons d’urine.