Cellules souches du liquide amniotique et de la membrane amniotique : Découverte de marqueurs

Abstract

Le liquide amniotique (FA) et la membrane amniotique (MA) ont été récemment caractérisés comme des sources prometteuses de cellules souches ou progénitrices. Les deux contiennent non seulement des sous-populations avec des caractéristiques de cellules souches ressemblant aux cellules souches adultes, telles que les cellules souches mésenchymateuses, mais présentent également certaines propriétés de cellules souches embryonnaires comme (i) l’expression de marqueurs de pluripotence, (ii) une forte expansion in vitro, ou (iii) une capacité de différenciation multi-linéaire. Des efforts récents ont été consacrés à l’isolement et à la caractérisation détaillée de ces types de cellules souches. Cependant, les variations de leur phénotype, leur hétérogénéité décrite par différents groupes et l’absence d’un marqueur unique exprimé uniquement dans ces cellules peuvent empêcher l’isolement d’une population pure et homogène de cellules souches à partir de ces sources et l’utilisation potentielle de ces cellules dans des applications thérapeutiques. Dans cet article, nous visons à résumer les progrès récents dans la découverte de marqueurs pour les cellules souches dérivées de sources fœtales telles que l’AF et l’AM, en utilisant de nouvelles méthodologies basées sur la transcriptomique, la protéomique ou les analyses du sécrétome.

1. Introduction

Le liquide amniotique (FA) et la membrane amniotique (MA) représentent tous deux de riches sources de cellules souches qui peuvent être utilisées à l’avenir pour des applications thérapeutiques cliniques. Les préoccupations éthiques relatives à l’isolement des cellules souches à partir de ces sources sont minimisées, contrairement aux questions soulevées par la recherche sur les cellules souches embryonnaires humaines (ESC). La FA est prélevée au cours d’amniocentèses programmées entre la 15e et la 19e semaine de gestation pour le diagnostic prénatal et l’excédent d’échantillon peut être utilisé pour le sourçage des cellules, tandis que la MA est généralement prélevée au cours des césariennes des grossesses à terme. Étant donné l’hétérogénéité des populations de cellules souches provenant de ces sources, l’isolement de types de cellules spécifiques est difficile et nécessite une caractérisation phénotypique et moléculaire détaillée des cellules respectives. Les études qui incluent des approches omiques sont fondamentales pour mieux comprendre les mécanismes d’expression moléculaire de ces cellules et définir les méthodologies correctes pour leur isolement, avant leur utilisation dans des approches thérapeutiques.

Cet article vise à présenter les principales caractéristiques biologiques et moléculaires des cellules souches dérivées de l’AF et de l’AM et également à souligner les avancées récentes dans la découverte de marqueurs en utilisant des méthodologies globales, telles que la transcriptomique, la protéomique ou les analyses du sécrétome.

1.1. Le liquide amniotique

L’AF sert de liquide protecteur pour l’embryon en développement, fournissant un support mécanique et les nutriments nécessaires pendant l’embryogenèse . L’amniocentèse est utilisée depuis plusieurs décennies comme procédure de routine pour le caryotype fœtal et le diagnostic prénatal, permettant la détection d’une variété de maladies génétiques .

Le composant principal du FA est l’eau ; cependant sa composition globale varie tout au long de la grossesse. Au début de la grossesse, l’osmolarité amniotique est similaire à celle du plasma fœtal. Après la kératinisation de la peau du fœtus, l’osmolarité amniotique diminue par rapport au plasma maternel ou fœtal, principalement en raison de l’afflux d’urine fœtale. Il est plus intéressant de noter que la FA représente également une riche source de cellules souches provenant soit du fœtus, soit de la membrane amniotique environnante. Des recherches supplémentaires menées par plusieurs groupes ont été récemment axées sur les propriétés cellulaires des cellules dérivées du liquide amniotique et leur utilisation potentielle dans des modèles précliniques et dans des thérapies de transplantation .

1.1.1. Les cellules souches du liquide amniotique (CSFA)

Les cellules du liquide amniotique (CSFA) représentent une population hétérogène dérivée des trois couches germinales. Ces cellules partagent une origine épithéliale et sont dérivées soit de l’embryon en développement, soit de la surface interne de la membrane amniotique, qui sont caractérisées comme des cellules souches de membrane amniotique . Les AFC sont principalement composées de trois groupes de cellules adhérentes, classées en fonction de leurs caractéristiques morphologiques, de croissance et biochimiques . Les cellules épithélioïdes (de type E) sont des cellules cuboïdes à cylindriques dérivées de la peau et de l’urine du fœtus, les cellules du liquide amniotique (de type AF) proviennent des membranes fœtales et les cellules fibroblastiques (de type F) sont générées principalement à partir du tissu conjonctif fibreux. Les cellules de type AF et F partagent une morphologie fibroblastique et le type cellulaire dominant semble être le type AF, qui coexprime les kératines et les vimentines . Plusieurs études ont montré que les cellules souches du liquide amniotique humain (CSFA) peuvent être facilement obtenues à partir d’une petite quantité de liquide amniotique du deuxième trimestre, prélevée lors d’amniocentèses de routine, une procédure dont le taux d’avortement spontané varie de 0,06 à 0,5 %. Jusqu’à présent, un certain nombre de protocoles de culture différents ont été rapportés, conduisant à des populations de cellules souches enrichies. L’isolement des CSFA et les protocoles de culture respectifs ont été résumés dans une revue récente par Klemmt et al. et peuvent être classés comme suit : (i) un protocole de culture en une seule étape, dans lequel la culture primaire a été laissée non perturbée pendant 7 jours ou plus jusqu’à l’apparition des premières colonies, (ii) un protocole de culture en deux étapes, dans lequel les amniocytes, non fixés après 5 jours de culture, ont été collectés et développés, (iii) une sélection des marqueurs de surface cellulaire pour CD117 (récepteur c-kit), (iv) un isolement mécanique des colonies initiales de cellules progénitrices mésenchymateuses formées dans les cultures initiales, et (v) des cultures à court terme pour isoler les colonies fibroblastiques. La majorité des AFSCs, isolées selon ces méthodologies, partageaient un phénotype mésenchymateux multipotent et présentaient un potentiel de prolifération plus élevé et un potentiel de différenciation plus large par rapport aux MSCs adultes .

1.2. Membrane amniotique (MA)

La membrane amniotique, dépourvue de tout tissu vasculaire, forme la majeure partie de la couche interne de la membrane fœtale et est composée de 3 couches : (i) une monocouche épithéliale constituée de cellules épithéliales, (ii) une couche basale intermédiaire acellulaire, et (iii) une couche externe de cellules mésenchymateuses, riche en cellules souches mésenchymateuses et placée à proximité immédiate du chorion . L’AM a été utilisé en clinique pendant plusieurs décennies pour la cicatrisation des brûlures, la promotion de la formation de l’épithélium et la protection contre les infections . Récemment, l’utilisation de l’AM a été évaluée comme matériau de pansement pour les défauts chirurgicaux de la muqueuse buccale , la reconstruction de la surface oculaire , les perforations cornéennes et l’augmentation de la vessie .

1.2.1. Cellules souches de membrane amniotique (AMSC)

Les cellules souches de membrane amniotique (AMSC) comprennent deux types, les cellules épithéliales amniotiques (AEC) et les cellules souches mésenchymateuses de membrane amniotique (AM-MSC) dérivées des couches épithéliales amniotiques et des couches mésenchymateuses amniotiques, respectivement . Les deux types de cellules proviennent des stades de prégastrulation de l’embryon en développement, avant la délimitation des trois couches germinales primaires, et sont principalement de nature épithéliale. Divers protocoles ont été établis pour l’isolement des AEC et des AM-MSC, principalement basés sur la séparation mécanique de l’AM de la membrane chorionique et la digestion enzymatique ultérieure. Les AM-MSC présentent une adhérence plastique et une morphologie fibroblastoïde, tandis que les AEC présentent un phénotype épithélial de type pavé. Les AM-MSC partageaient des caractéristiques phénotypiques similaires à celles dérivées de sources adultes. De manière plus intéressante, les AM-MSCs, de manière similaire aux AF-MSCs, ont montré un taux de prolifération plus élevé comparé aux MSCs dérivées de sources adultes et un potentiel de différenciation multi-linéaire en cellules dérivées des trois couches germinales .

2. immunophénotype

2.1. Cellules souches du liquide amniotique

Le FA a récemment émergé comme une source fœtale alternative d’une variété de cellules d’origine souche . Ici, nous visons à résumer les marqueurs clés qui caractérisent les CSFA. A ce jour, les CSMs représentent la sous-population la mieux caractérisée des CSFAs. Les AF-MSC présentaient une expression typique des marqueurs mésenchymateux, tels que CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58 et CD44, déterminée par des analyses de cytométrie de flux . De plus, ces cellules exprimaient les antigènes HLA-ABC, tandis que l’expression des marqueurs hématopoïétiques CD34 et CD45, du marqueur endothélial CD31 et de l’antigène HLA-DR n’était pas détectée. Plus important encore, la majorité des AF-MSC cultivées exprimaient des marqueurs de pluripotence tels que la protéine de liaison octamère 3/4 (Oct-3/4), le facteur de transcription homebox Nanog (Nanog) et l’antigène embryonnaire spécifique de stade 4 (SSEA-4) .

Il a également été signalé que les cultures d’amniocytes contiennent une petite population de cellules positives CD117 (une tyrosine kinase spécifique du facteur de cellule souche présent principalement dans les ESC et les cellules germinales primordiales) qui peuvent être étendues de manière clonale en culture . Les propriétés de différenciation des AFS CD117+ ont été testées pour la première fois in vivo, prouvant ainsi leur identité de cellules souches. Des preuves expérimentales ont suggéré que les AFSCs sont dérivées de cellules fibroblastoïdes fusiformes .

Dans une tentative d’analyser les sous-populations d’AFSCs, notre groupe a récemment identifié deux populations morphologiquement distinctes d’AFSCs d’origine mésenchymateuse, avec des propriétés de prolifération et de différenciation différentes, appelées spindle shaped (SS) et round shaped (RS) . Les deux sous-populations exprimaient des marqueurs de cellules souches mésenchymateuses à des niveaux similaires. Cependant, il a été identifié que les colonies SS exprimaient des niveaux plus élevés d’antigènes CD90 et CD44 par rapport aux colonies RS .

2.2. Cellules souches de la membrane amniotique (AMSCs)

Une analyse immunophénotype détaillée des AMSCs a révélé l’expression d’antigènes, tels que CD13, CD29, CD44, CD49e, CD54, CD73, CD90, CD105, , CD166, , le marqueur 1 des cellules souches stromales (Stro-1), SSEA-3, SSEA-4, le collagène I et III (Col1/Col3), l’alpha-smooth muscle actin (α-SMA), CD44, la vimentine (Vim), la protéine de surface des fibroblastes (FSP) et l’antigène HLA-ABC. Cependant, la molécule d’adhésion intercellulaire 1 (ICAM-1) était exprimée à des niveaux très faibles et les protéines TRA-1-60, la protéine d’adhésion cellulaire vasculaire 1 (VCAM-1), le facteur de von Willebrand (vWF), la molécule d’adhésion cellulaire endothéliale plaquettaire (PECAM-1), CD3 et HLA-DR n’ont pas été détectées. L’une des protéines les plus abondantes trouvées dans les cellules dérivées de l’AM est la laminine, qui joue un rôle clé dans la différenciation, la forme et la migration des cellules, et la régénération des tissus. L’analyse RT-PCR a en outre montré que les AMSC exprimaient des gènes tels que Oct-3/4, la protéine à doigt de zinc 42 (zfp42 ou Rex-1), la protéine du facteur des cellules souches (SCF), la molécule d’adhésion des cellules neurales (NCAM), la nestine (NES), la protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP-4), la protéine de liaison GATA 4 (GATA-4) et le facteur nucléaire hépatocytaire 4α (HNF-4α), même à des passages élevés. Les transcriptions du brachyury, du facteur de croissance des fibroblastes 5 (FGF5), de la protéine de la boîte appariée (Pax-6) et de la protéine morphogénétique osseuse 2 (BMP2) n’ont pas été détectées. De même, les analyses FACS ont révélé que les CEA étaient positifs pour les expressions CD10, CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC et négatifs pour les expressions CD14, CD34, CD45, CD49d et HLA-DR. Une enquête plus approfondie a montré que les CEA exprimaient des marqueurs de cellules souches tels que SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, région déterminant le sexe Y-box 2 (Sox2), Tra1-60 et Tra1-80, facteur de croissance des fibroblastes 4 (FGF4), Rex-1, protéine cryptique (CFC-1), et prominine 1 (PROM-1) .

3. transcriptomique

3.1. Cellules souches du liquide amniotique

Une analyse fonctionnelle de la signature de l’expression des gènes des CSM de l’AF comparée à celle des CSM de la moelle osseuse (BM), du sang de cordon (CB) et de l’AM a été initialement réalisée par Tsai et al . Les gènes exprimés dans les CSM des trois sources ont pu être classés en groupes liés (i) au remodelage de la matrice extracellulaire (CD44, collagène II (COL2), facteur de croissance analogue à l’insuline 2 (IGF2), et inhibiteur tissulaire de la métalloprotéinase 1 (TIMP1)), (ii) la régulation du cytosquelette (activateur du plasminogène de type urokinase (PLAU) et récepteur (PLAUR)), (iii) la régulation des chimiokines et l’adhésion (alpha actinin 1 (ACTN1), sous-unité 1B du complexe protéique lié à l’actine (ARPC1B) et thrombospondine 1 (THBS1)), (iv) activation de la plasmine (inhibiteur 2 de la voie du facteur tissulaire (TFPI2)), (v) la signalisation des récepteurs du facteur de croissance transformant β (TGFβ) (cavéoline 1 (Cav1), cavéoline 2 (Cav2), inhibiteur 1A de la kinase dépendante de la cycline (CDKN1A)), et (vi) les gènes codant pour les ubiquitines ligases E3 (SMURF). Les gènes régulés à la hausse dans les AF-MSC par rapport aux BM-, CB- et AM-MSC comprenaient des molécules impliquées dans la maturation et la contraction utérines, comme le récepteur de l’ocytocine (OXTR) et la régulation de la synthèse des prostaglandines, comme la phospholipase A2 (PLA2G10). D’autres gènes régulés à la hausse dans ce groupe étaient impliqués dans la transduction du signal liée à (i) la réponse déclenchée par la thrombine ((F2R et F2RL)), (ii) la signalisation hedgehog ((hedgehog acyltransférase (HHAT)), et (iii) les voies liées à la protéine G (rho-related GTP-binding protein (RHOF), regulator of G protein signaling 5 and 7 (RGS5, RGS7), et phospholipase C beta 4 (PLCB4)) .

Dans des études récentes sur les AFSCs, Kim et al. ont décrit pour la première fois les changements d’expression génique dans la population totale d’AFSCs au cours de différents passages par l’analyse de microarray illumina. 1970 gènes différentiellement exprimés ont été détectés et catégorisés selon leurs profils d’expression en 9 clusters distincts . Les gènes dont les niveaux d’expression augmentent progressivement comprennent le ligand de la chimiokine (motif C-X-C) 12 (CXCL12), la cadhérine 6 (CDH6) et le récepteur de folate 3 (FOLR3). Les gènes dérégulés étaient, entre autres, la cycline D2 (CCND2), la kératine 8 (K8), l’IGF2, le précurseur du peptide natriurétique (BNP) B et la protéine 2 de liaison à l’acide rétinoïque cellulaire (CRABPII). Pour obtenir des informations supplémentaires, une analyse des données des puces sur les gènes du vieillissement a été réalisée et a révélé une régulation à la hausse des transcriptions de gènes, tels que le facteur de croissance des nerfs bêta (NGFβ), le substrat du récepteur de l’insuline 2 (IRS-2), la protéine de liaison du facteur de croissance analogue à l’insuline 3 (IGFBP-3) et l’apolipoprotéine E (APOE). Expression de gènes, tels que PLAU, le facteur de transcription E2F 1 (E2F1), IGF2, le gène de susceptibilité au cancer du sein de type 1 (BRCA1), l’ADN topoisomérase 2-alpha (TOP2A), l’antigène nucléaire des cellules proliférantes (PCNA), forkhead box M1 (FOXM1), le gène de la cycline-A2 (CCNA2), le budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta (BUB1B) et la cycline dependent kinase 1 (CDC2), a été progressivement dérégulé pendant la culture .

Wolfrum et al. ont réalisé une analyse globale de l’expression génique des AFSCs par rapport aux iPSCs dérivées de AF (AFiPSC) et aux ESCs . Parmi ceux-ci, les gènes liés à l’auto-renouvellement et à la pluripotence (1299 gènes, par exemple POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), Sox2, Nanog, protéine de liaison aux microARN LIN28) et à la spécificité des AFSCs (665 gènes, par exemple, OXTR, HHAT, RGS5, neurofibromatose de type 2 (NF2), protectine (CD59), membre de la superfamille du facteur de nécrose tumorale 10 (TNFSF10), 5′-nucléotidase (NT5E)) ont été détectés dans les CSFA. De plus, les auteurs ont examiné l’expression des gènes associés à la sénescence et aux télomères dans les AFSCs de passage précoce et tardif, afin d’étudier l’effet de la reprogrammation sur le contournement de la sénescence observée dans les cultures d’AFSCs. Soixante-quatre gènes ont été identifiés comme différentiellement exprimés dans les AFSCs par rapport aux lignées AFiPSC. Parmi ceux-ci, les gènes associés aux télomères et les gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire, tels que MAD2L2 (mitotic arrest deficient-like 2), PARP1 (poly ADP-ribose polymerase 1), RPA3 (replication protein A3), DKC1 (dyskeratosis congenita 1), MSH6 (mutS homolog 6), CHEK1 (CHK1 checkpoint homolog), PLK1 (polo-like kinase 1), l’homéoboxe POU classe 2 1 (POU2F1), le CDC2, le gène du syndrome de Bloom RecQ hélicase-like (BLM), le syndrome de Werner RecQ hélicase-like (WRN), l’ADN méthyltransférase 1 (DNMT1), l’ADN méthyltransférase 3 bêta (DNMT3B), la lamine B1 (LMNB1) et le facteur de réplication de l’ADN 1 (CDT1), étaient régulés à la baisse dans les CSFA par rapport aux CSFA et aux CSE. En revanche, la peptidylprolyl cis/trans isomérase (PIN1), la lamine A/C (LMNA), l’arrêt de croissance et les dommages à l’ADN induisibles alpha (GADD45A), l’homologue chromobox 6 (CBX6), la NADPH oxydase 4 (NOX4), l’endogline (ENG), histone H2B type 2-E (HIST2H2BE), CDKN1A, CDKN2A facteur de différenciation de croissance 15 (GDF15), et inhibiteur de protéase à sérine 1 (SERPINE1), entre autres, étaient régulés à la hausse dans les AFSCs par rapport aux AFiPSCs et ESCs .

3.2. Cellules souches à membrane amniotique

Une analyse transcriptomique utilisant des microréseaux d’ADN a été rapportée pour les AM-MSCs . Ces données expérimentales ont fourni des informations sur le schéma d’expression génique des AM-MSC par rapport aux profils d’expression génique des AF, CB et BM-MSC. Plusieurs gènes régulés à la hausse dans les AM-MSCs impliqués dans la régulation de l’adaptation immunitaire entre l’interface materno-placentaire ont été identifiés. Entre autres, la spondine 2 (SPON2), la protéine 27 inductible de l’interféron alpha (IFI27), le récepteur B1 de la bradykinine (BDKRB1), les membres 5 et 6 de la sous-famille B des petites cytokines inductibles (SCYB5, SCYB6), et l’homologue de l’oncogène lié au virus du sarcome de Yamaguchi (LYN) sont régulés à la hausse. En outre, d’autres gènes présentant une expression accrue dans les CSM-AM par rapport aux CSM-AF, CB et BM comprenaient (i) des facteurs de transcription, tels que la boîte de forkhead F1 (FOXF1), les dérivés du cœur et de la crête neurale exprimés 2 (HAND2) et le facteur de transcription 21 (TCF21) et (ii) des enzymes métaboliques, tels que la dipeptidyl-peptidase 6 (DPP6), la tryptophane 2,3-dioxygénase (TDO2) et les sialyltransférases (STs) .

4. protéomique

4.1. Cellules souches du liquide amniotique

Les études protéomiques sur la population totale des AFSC, y compris les cellules épithélioïdes (type E), spécifiques du liquide amniotique (type AF) et fibroblastiques (type F), ont révélé 2400 spots qui ont permis d’identifier 432 produits génétiques différents. La majorité des protéines était localisée dans le cytoplasme (33%), les mitochondries (16%) et le noyau (15%) et représentait principalement des enzymes (174 protéines) et des protéines structurelles (75 protéines). Un pourcentage relativement élevé de protéines membranaires et associées à la membrane était également présent (7%). Parmi les protéines détectées, 9 correspondaient aux cellules épithéliales, telles que la chaîne D de l’ATP synthase (ATP5H), la sous-unité 30 kDa de la NADH-ubiquinone oxydoréductase (NUIM), l’annexine II (Anx2), l’annexine IV (Anx4), la protéine ribosomale 40S SA (Rpsa), la glutathion S-transférase P (GSTP), la protéine de voûte majeure et les cytokératines 19 et 7 (CK-19, CK-7), tandis que 12 protéines ont été signalées comme étant exprimées dans les fibroblastes, notamment les fibronectines, les tropomyosines, la transgéline (TAGLN), la sous-unité 34 kDa du complexe arp2/3 (P34-arp), la gelsoline (Gsn), le facteur d’élongation 1-β (EF-1β) et d’autres. Huit protéines ont été trouvées exprimées dans les kératinocytes, y compris les kératines, les ribonucléoprotéines, Anx2, l’aetyl-CoA acétyl-transférase (ACAT1), et d’autres, trois à être exprimées dans l’épiderme, y compris les tropomyosines et les kératines et une dans le type de cellule mésenchymateuse (vimentine 1 (Vim 1)) .

Des études récentes ont fourni des preuves qu’une diversité d’expression d’enzymes métaboliques dans les cellules de l’amnios est impliquée dans des syndromes métaboliques et génétiques, et donc, leur détection pourrait être importante pour le diagnostic prénatal. Une analyse plus détaillée pour déterminer les enzymes métaboliques spécifiques présentes dans les CSFA a été rapportée par Oh et al. . Quatre-vingt-dix-neuf protéines avaient été identifiées, telles que les enzymes de manipulation des glucides, les enzymes de manipulation des acides aminés, les protéines du métabolisme des purines et les enzymes du métabolisme intermédiaire .

Une analyse protéomique a également été réalisée sur différents passages de culture de CSFA CD117+, montrant des variations dans l’expression des protéines qui se produisent principalement dans les premiers passages . Vingt-trois protéines ont été exprimées de manière différentielle entre les passages précoces et tardifs, les protéines les plus dérégulées étant la Col1, la Col2, la vinculine (Vcl), la CRABP II, la stathmine (STMN1) et la cofiline-1 (CFL1). En revanche, TAGLN et Col3 sont augmentés au cours des passages . Les protéines qui ont montré des niveaux dysrégulés le long des passages sont la sous-unité 7 régulatrice de la protéase 26S (PSMD7), l’isoenzyme L1 de l’ubiquitine carboxyl terminal hydrolase (UCH-L1), la protéine ribonucléaire hétérogène H (hnRNP H) et la protéine 43 de liaison à l’ADN TAR (TDP-43) .

En 2007, la carte protéomique des AF-MSCs humaines a été construite et directement comparée à celle dérivée des BM-MSCs . 261 protéines différentes ont été identifiées dans les AF-MSCs avec la majorité des protéines localisées dans le cytoplasme (41%), tandis que d’autres ont été trouvées dans le réticulum endoplasmique (8%), le noyau (13%), les mitochondries (12%), les ribosomes (1%), le cytosquelette (6%), le cytoplasme et le noyau (5%), et les protéines sécrétées (2%) . Les AF-MSC ont exprimé un certain nombre de protéines liées à la prolifération et à la maintenance cellulaire, telles que l’ubiquiline-1 (UBQLN1), connue pour contrôler la progression du cycle cellulaire et la croissance cellulaire, la protéine 2G4 associée à la prolifération (PA2G4), une protéine régulatrice de la croissance nucléolaire, la protéine sécrétée acide et riche en cystéine (SPARC), qui est régulée pendant l’embryogenèse et est impliquée dans le contrôle du cycle cellulaire et de l’adhésion cellulaire, et l’enhancer of rudimentary homolog (ERH) qui régule également le cycle cellulaire . TAGLN et la galectine 1 (Gal 1), toutes deux présentes dans les cellules souches et liées à la différenciation, étaient également abondamment exprimées dans les AF-MSC. D’autres protéines exprimées à des niveaux élevés dans les CSAMF étaient liées (i) au développement, comme Deltex-3-like (DTX3L), et (ii) à l’organisation et au mouvement du cytosquelette, comme CFL1, la protéine coactosin-like (CLP), et l’homologue de la protéine enabled (Enah). Comme prévu, Vim était également exprimé en grande quantité dans les CSM-FA. Dans cette étude, une comparaison détaillée des protéines identifiées communes dans les cellules AF et AF-MSCs a également été décrite .

Dans notre étude ultérieure , nous avons établi la carte protéomique des deux types de cellules progénitrices mésenchymateuses AF morphologiquement distinctes (SS et RS) par 2-DE. Vingt-cinq protéines ont été exprimées de manière différentielle dans les deux sous-populations. Les protéines régulées à la hausse dans les SS-AF-MSC par rapport aux RS-AF-MSC comprenaient le précurseur de la réticulocalbin-3 (RCN3), le collagène α1 (I) (COL1α1), le précurseur de la protéine 9 de liaison au FK506 (FKBP9), l’inhibiteur 1 de dissociation du Rho GDP (RhoGDI), la protéine 4 du canal intracellulaire du chlorure (CLIC4), la tryptophanyl-tRNA synthétase (TrpRS) et la protéine de choc thermique de 70 kD (HSP70). La peroxiredoxine 2 (Prdx2), la protéine de choc thermique de 60 kD (HSP60), la GSTP et l’Anx4 étaient régulées à la hausse dans les RS-AFMPC. Cependant, les protéines identifiées dans les RS-AF-MSC ne comprenaient que la cytokératine-8, -18 et -19 (CK-8, -18 et CK-19), la cathepsine B (CTSB), la CLP et la protéine de l’intégrine αV (CD51). Les protéines liées au mésenchyme, telles que Vim, Gal, Gsn, et la prohibitine (PHB), étaient exprimées aux mêmes niveaux dans les deux populations .

4.2. Cellules souches de la membrane amniotique

Une approche détaillée pour étudier les protéines AM humaines a été décrite par Hopkinson et al . Dans cette étude, les auteurs ont réalisé une analyse protéomique d’échantillons de MA qui ont été préparés pour la transplantation humaine, en utilisant des gels 2-DE. Les milieux de lavage des échantillons de MA ont également été examinés et les protéines sécrétées ont été identifiées. Les protéines détectées à la fois dans l’AM et dans les milieux de lavage suggèrent qu’une libération partielle des protéines a eu lieu. Ces protéines étaient pour la plupart des protéines cytoplasmiques solubles et ont été classées en fonction de leur localisation subcellulaire et de leur fonction. Un exemple des protéines les plus abondantes et les plus cohérentes dans l’AM est la THBS1, qui jouerait un rôle dans la réparation des plaies, la réponse inflammatoire et l’angiogenèse. Le mimécan (également appelé ostéoglycine/OGN) est une autre protéine détectée dans l’AM qui représente un petit protéoglycane riche en leucine, présent dans la MEC du tissu conjonctif. Le mimécan est réputé maintenir la résistance à la traction et l’hydratation du tissu. En outre, la plus grande forme de mimécan était exprimée dans les cellules AM et était susceptible de subir un clivage protéolytique. La protéine ig-h3 induite par le TGF-β (βIG-H3), une molécule adhésive de la MEC agissant comme un facteur de croissance associé à la membrane pendant la différenciation cellulaire et la cicatrisation, et l’intergrine α6 (CD49f), un composant de l’intégrine α6β4, étaient également présentes en quantités significatives dans les cellules AM . Il est bien connu que l’interaction α6β4-βIG-H3 joue un rôle important dans la médiation des voies de signalisation de l’adhésion cellulaire et de la réparation des plaies .

Une autre étude importante de Baharvand et al. était axée sur l’analyse de l’AM humain dénudé par l’épithélium montrant des différences quantitatives et qualitatives par rapport à l’AM non traité . Ils ont étudié le protéome de l’épithélium de la MA humaine, qui a été utilisé comme une niche de cellules souches limbiques pour traiter la reconstruction de la surface oculaire. 515 points ont été détectés dans tous les gels 2-DE et 43 protéines ont été identifiées par MALDI TOF/TOF MS dans l’AM. Les protéines les plus abondantes étaient différentes isoformes de lumican (LUM) et d’OGN, tous deux membres de la famille des protéoglycanes (PG). En particulier, l’OGN pourrait jouer un rôle dans de nombreux processus biologiques, notamment la croissance cellulaire, l’angiogenèse et l’inflammation. Parmi les autres protéines détectées figurent le collagène VI α-1/α-2 (Col6a1/Col6a2), la chaîne bêta du fibrinogène (FGB), l’isoforme A de la transglutaminase 2 (TGM2A), la variante de la b-actine (ACTB), la protéine de choc thermique 5 (HSPA5) de 70 kD, le nidogène 2 (NID2), CD49f, la βIG-H3 et la néphrite tubulo-interstitielle (TIN) . Certaines des protéines identifiées dans cette étude étaient également liées à la matrice extracellulaire (MEC). Parmi celles détectées, la fibronectine (FN), les laminines et les collagènes IV (Col4) et VII ont été signalés comme favorisant l’adhésion et la migration épithéliale .

5. Secretome

Récemment, des progrès significatifs ont été réalisés concernant l’analyse des protéines sécrétées par les AFSC. Il a été documenté que le sécrétome des AFSC était responsable de l’amélioration de la vasculogenèse et était capable d’évoquer une forte réponse angiogénique chez les receveurs murins . Selon cette étude, une analyse détaillée du milieu conditionné des CSFA a révélé la présence de facteurs proangiogéniques et antiangiogéniques connus en utilisant la technologie MAP de Luminex. Le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), le facteur 1 dérivé des cellules stromales (SDF-1), l’interleukine 8 (IL-8), la protéine 1 chimiotactique des monocytes (MCP-1) et deux inhibiteurs de l’angiogenèse, l’interféron gamma (IFNγ) et la protéine 10 induite par l’interféron gamma (IP-10), ont été identifiés comme des protéines sécrétées. Il a également été démontré qu’un nombre relativement faible d’AFSC était suffisant pour sécréter une quantité détectable de facteurs de croissance et de cytokines proangiogéniques. La sécrétion de ces derniers peut être régulée de manière dose-dépendante en fonction du nombre initial de cellules utilisées .

Une étude systématique sur les protéines sécrétées par les AFSC a conduit à la conclusion que les facteurs solubles proangiogéniques provenant des AFSC peuvent médier le recrutement des progéniteurs endothéliaux dans un modèle de rat ischémique . En particulier, le milieu conditionné dérivé des CSFA pouvait délivrer topiquement des facteurs de croissance angiogéniques et des cytokines dans le lambeau de peau du modèle de rat ischémique et était responsable du déclenchement de la réparation endogène en recrutant des cellules progénitrices endothéliales .

Dans nos études récentes, nous avons examiné le potentiel thérapeutique d’une CSFA-MSC et de leurs molécules sécrétées chez des souris souffrant d’insuffisance hépatique aiguë . Une variété de cytokines et de facteurs de croissance ont été détectés dans le milieu conditionné des AF-MSC. Des cytokines telles que l’interleukine 10 (IL-10), l’interleukine 27 (IL-27), la famille de l’interleukine 17 (IL-17E), l’interleukine 12p70 (IL-12p70), l’interleukine-1 bêta (IL-1β) et l’antagoniste du récepteur de l’interleukine-1 (IL-1ra), responsables de l’induction d’une régulation locale et systémique des médiateurs pro-inflammatoires, ont été détectées. SERPINE1, MCP-1, et SDF-1, responsables de la promotion de la réparation des tissus, ont également été sécrétés. Il est intéressant de noter que parmi les facteurs de croissance fortement exprimés figuraient le facteur de croissance des cellules endothéliales dérivé des plaquettes (PD-ECGF), l’endostatine/collagène XVII (EN/Col17), l’activateur urinaire du plasminogène (uPA), TIMP1, TIMP2, le facteur de croissance analogue à l’EGF à liaison héparine (HB-EGF), le facteur de croissance des fibroblastes 7 (FGF7) et le facteur de croissance épidermique (EGF), responsables de la régénération du foie et de la réparation des tissus .

6. Résumé

Les données actuelles jusqu’à présent suggèrent que le liquide amniotique et la membrane amniotique peuvent représenter des sources prometteuses de cellules souches d’origine mésenchymateuse. En effet, les CSM sont plus abondantes et un large éventail de protocoles a été décrit pour leur isolement. Cependant, il est rapporté que différentes conditions de culture du même type de cellules peuvent affecter leur modèle d’expression génétique différentiel, ce qui représente une limitation pour leur isolement et leur expansion in vitro. Des études comprenant une analyse phénotypique, utilisant des méthodologies telles que la cytométrie de flux et l’immunohistochimie, ainsi que des approches transcriptomiques, protéomiques et d’analyses du sécrétome, visent à déterminer le profil protéique de ces cellules (Figure 1). Les données générées par ces études devraient permettre de clarifier leur répertoire différentiel et de valider le profil moléculaire de ces cellules souches. Cependant, le principal problème qu’il est urgent de résoudre est l’isolement d’une population homogène qui pourrait faciliter les études systématiques pour l’élucidation de la fonction de ces cellules multipotentes.

Figure 1

Résumé des marqueurs les plus importants identifiés dans les AFC et les AMC par l’utilisation d’analyses transcriptomiques, protéomiques, sécrétomiques et immunophénotypiques. Les protéines identifiées dans plus d’une étude sont marquées en gras.

Ces approches peuvent conduire à l’identification d’antigènes clés qui reflètent le phénotype de ces cellules et expliquent leurs propriétés caractéristiques distinctes. Ce type d’études ouvrira la voie à un isolement systématique et efficace de ces cellules avant leur utilisation en milieu clinique.

Annexe

Questions à approfondir

Quelles sont les méthodes d’isolement et les conditions de culture appropriées des AFSCs ou AMSCs qui permettront l’identification d’un phénotype cohérent ?

Est-ce qu’il existe un marqueur unique qui peut être utilisé pour l’isolement des AFSCs ou AMSCs ?

Les populations d’AFSCs et d’AMSCs sont hétérogènes et diffèrent dans leurs propriétés phénotypiques et moléculaires. Les méthodes d’isolement peuvent aboutir à une population cellulaire homogène.

Les AFSCs ou AMSCs peuvent être utilisées comme outils en médecine régénérative : établissement de conditions de culture avec un minimum ou pas de substances animales.

Découverte de marqueurs
La caractérisation initiale des AFSCs et des AMSCs peut être réalisée par une analyse immunophénotypique en utilisant des marqueurs de surface cellulaire bien caractérisés tels que AFSCs : CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58, CD44, HLA-ABC, SSEA-4 ; AMSCs : CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, Sox2, Tra1-60, Tra1-80, FGF-4, CFC-1, et PROM1.

La transcriptomique et la protéomique ont révélé l’identification de marqueurs clés exprimés tels que
AFSCs : Nanog, Sox2, POU5F1, NF2, IGF2, PLAU, OXTR, HHAT, RCS5, CDC2, COL2, TAGLN, Gsn, Anx4, GSTP, CK-19, Vim, Col1 et Gal ; AMSCs : OGN, βIG-H3 et CD49F.
Puisqu’il n’y a pas de marqueur commun disponible pour les AFSC et les AMSC, un panel plus large de marqueurs doit être employé. Cela incite également à la conduction d’autres analyses détaillées de réseaux et d’analyses fonctionnelles afin de définir les marqueurs les plus appropriés pour la caractérisation des AFSC et des AMSC.

Conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d’intérêts.