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Plusieurs des enzymes impliquées dans la biogenèse des peptides ont été identifiées

Les étapes les plus courantes du traitement des précurseurs et les enzymes impliquées sont présentées dans la figure 18-5. Les endoprotéases impliquées sont les prohormone convertases 1 et 2 (PC1 et PC2), l’exopeptidase est la carboxypeptidase E (CPE, également appelée CPH et enképhaline convertase) et l’enzyme α-amidante est la peptidylglycine α-amidante mono-oxygénase (PAM). De nombreuses étapes de leur biosynthèse ne sont pas propres aux neuropeptides, comme le clivage du peptide signal, la formation de liaisons disulfure, l’ajout et la modification ultérieure d’oligosaccharides N-liés et O-liés, la phosphorylation et la sulfatation. Comme le montre le schéma de la figure 18-3, de nombreuses étapes post-traductionnelles se produisent lorsque les neuropeptides en cours de maturation descendent l’axone vers la synapse dans les LDCV. Les étapes ultérieures de la biosynthèse des neuropeptides (figure 18-5) sont propres aux neurones et aux cellules endocrines.

Les enzymes clés de la biosynthèse des neuropeptides comprennent les endoprotéases, les exoprotéases et les enzymes modifiant les extrémités des peptides. La découverte et la caractérisation de Kex2p, l’endoprotéase qui clive le pro-α-facteur d’accouplement de la levure pour produire quatre copies de la phéromone α-facteur d’accouplement (figure 18-2), ont été essentielles à la découverte des convertases de prohormones de mammifères, notamment la furine, PC1/3, PC2, PC4, PC5/6, PC7/8/LPC et PACE4 . Les convertases de prohormone partagent une homologie avec les subtilisines bactériennes et possèdent une triade catalytique Asp-His-Ser, qui consiste en trois acides aminés clés impliqués dans la catalyse (désignés par D, H et S dans la figure 18-5). La région pro de chacune d’entre elles (Fig. 18-5) doit être présente pendant la biosynthèse pour que la protéase se replie correctement, mais elle doit être retirée pour donner une protéase activée. Pour la PC1 et la furine, l’élimination de la région pro se produit quelques minutes après la biosynthèse, alors que l’enzyme se trouve dans le réticulum endoplasmique, et il s’agit très probablement d’un événement autocatalytique. Pour les autres convertases de prohormone, l’élimination de la région pro est beaucoup plus lente. L’expression de la PC2 active nécessite la coexpression du peptide 7B2 (Fig. 18-5), qui semble exercer une fonction de chaperon et peut également empêcher l’expression de l’activité endoprotéolytique de la PC2 jusqu’à ce que celle-ci ait été déposée dans les granules sécrétoires. Aucun peptide chaperon/inhibiteur correspondant n’a été identifié pour les autres convertases de prohormones.

Les endoprotéases de mammifères les plus clairement impliquées dans le traitement des neuropeptides sont PC1 et PC2, des protéases Ca2+-dépendantes présentes dans les granules sécrétoires dont l’expression est limitée aux neurones et aux cellules endocrines (Fig. 18-5). Plusieurs autres membres de cette famille d’endoprotéases sont plus largement exprimés, tandis que d’autres encore sont exprimés dans des endroits restreints distincts des neurones et des cellules endocrines. Par exemple, la furine est présente dans pratiquement toutes les cellules et est localisée principalement dans le réseau trans-golgi ; la furine catalyse des clivages importants dans la fonction peptidique, comme le clivage initial des précurseurs de l’ELH, du facteur de croissance nerveuse et de l’hormone parathyroïdienne, ainsi que le clivage au sein du précurseur du récepteur de l’insuline pour produire la forme active αβ dimère du récepteur. La furine peut également jouer un rôle dans l’activation de certaines des autres enzymes de transformation, telles que la PC2 et la CPE.

La PC1 et la PC2 clivent des paires sélectionnées d’acides aminés basiques dans les précurseurs peptidiques : Lys-Arg, Arg-Arg, Lys-Lys et Arg-Lys. La PC1 peut également catalyser les clivages au niveau des sites Arg uniques sélectionnés présents dans certains précurseurs, tels que la prosomatostatine et la procholécystokinine. Les clivages dans les PDCV par les PC sont étroitement contrôlés et se produisent souvent de manière très ordonnée (Fig. 18-6). Les clivages initiaux de la POMC se produisent en moins d’une heure (Fig. 18-6, étapes 1 et 2), tandis que d’autres clivages ne se produisent qu’après plusieurs heures (Fig. 18-6, étapes 6 et 7). Le clivage endoprotéolytique des propeptides est souvent la réaction limitant la vitesse dans le traitement biosynthétique des peptides.

Le schéma des clivages catalysés par PC1, PC2 et furine lorsqu’ils sont exprimés dans les neurones et les cellules endocrines est beaucoup plus sélectif que le schéma des clivages observés dans les essais en tube à essai avec des enzymes purifiées. Par exemple, bien que les convertases des prohormones clivent généralement à l’extrémité COOH d’une paire de résidus basiques dans les substrats peptidiques modèles, dans les cellules, les clivages peuvent se situer au milieu des paires de résidus basiques, comme dans le cas du clivage de la POMC (Fig. 18-6), où les résidus basiques sont séparés et restent avec les deux peptides matures résultants . Il est probable que la concentration en Ca2+ et le pH interne des PDCV soient deux variables utilisées par les neurones et les cellules endocrines pour réguler l’activité endoprotéolytique dans les PDCV.

On peut montrer que d’autres endoprotéases jouent un rôle dans la biosynthèse des neuropeptides. Les principaux candidats sont l’homologue mammalien de l’aspartyl protéase-3 de la levure (YAP-3) et la N-arginine dibasique (NRD) convertase . Un autre aspect de la biosynthèse des peptides est observé dans le cœur, où le facteur natriurétique proatrial (proANF) est stocké dans les LDCV et où le FNA mature est libéré des cellules auriculaires dans la circulation. Le traitement du proANF, qui implique un clivage après un seul résidu Arg dans le proANF, ne peut pas impliquer la PC1 ou la PC2 puisqu’il y a des quantités négligeables de ces PC dans le cœur.

La PCPE est une protéine soluble que l’on trouve dans pratiquement toutes les LDCV des neurones et des cellules endocrines (figure 18-5) . Elle élimine les résidus basiques, Lys ou Arg, des terminaisons COOH des intermédiaires peptidiques produits par les convertases des prohormones. Elle a été identifiée à l’origine par sa distribution tissulaire et sa spécificité de substrat, ainsi que par son inhibition spécifique par l’acide guanidinoéthylmercaptosuccinique (GEMSA). La CPE est une enzyme activée par le Co2+ et le Zn2+, avec une courte pro-région qui est normalement retirée pendant la maturation de l’enzyme ; contrairement aux convertases de la prohormone, la CPE est active avec la pro-région attachée. La fonction carboxypeptidase du traitement des peptides n’est normalement pas limitante, car les intermédiaires peptidiques avec des résidus basiques COOH-terminaux ne sont détectés qu’à des concentrations extrêmement faibles dans les extraits de tissus ou de VLD. Récemment, d’autres carboxypeptidases ont été identifiées, notamment la CPE, une forme membranaire intégrale de l’enzyme avec 3 domaines carboxypeptidases. L’importance relative de la CPE et de ces carboxypeptidases supplémentaires dans le traitement des neuropeptides in vivo n’est pas claire. Étant donné que le clivage au niveau d’une paire de résidus basiques peut se faire au milieu de la paire, il y a de bonnes raisons de penser qu’une aminopeptidase sera trouvée dans les LDCV.

La PAM est une enzyme bifonctionnelle trouvée dans presque toutes les LDCV (figure 18-5) . La PAM agit sur les substrats peptidiques après un clivage endoprotéolytique et une action exopeptidase, lorsqu’un résidu Gly COOH-terminal est exposé, et convertit le peptidyl-Gly en le peptide-NH2 correspondant. Environ la moitié des peptides bioactifs connus sont α-amidés, et l’α-amidation est généralement cruciale pour la puissance biologique. Les formes peptidyl-Gly et peptide-COOH sont généralement inactives aux concentrations physiologiques. La première étape de la réaction d’α-amidation est réalisée par la peptidylglycine α-hydroxylante mono-oxygénase (PHM), qui est la partie NH2-terminale de la protéine bifonctionnelle PAM. La PHM lie deux atomes de Cu2+ qui participent à la catalyse en subissant des cycles de réduction et d’oxydation. La PHM utilise l’acide ascorbique comme réducteur, un atome d’oxygène provenant de O2 étant incorporé au peptide pendant l’étape d’hydroxylation. Ainsi, la PHM est enzymatiquement très similaire à la dopamine β-mono-oxygénase (DBM), qui convertit la dopamine en noradrénaline (voir Chap. 12). La deuxième étape de la réaction d’α-amidation est réalisée par un deuxième domaine enzymatique de la PAM, la peptidyl-α-hydroxyglycine α-amidating lyase (PAL). Le domaine PAL constitue une nouvelle enzyme dépendante des ions métalliques divalents. Les neurones expriment principalement une forme membranaire intégrale de la protéine PAM bifonctionnelle (Fig. 18-5), tandis qu’un événement supplémentaire d’épissage de l’ARNm permet à certaines cellules endocrines d’exprimer des versions solubles de la protéine, dépourvues du domaine transmembranaire. Dans les formes membranaires intégrales de la PAM, le court domaine COOH-terminal s’étend dans le cytoplasme et participe à l’acheminement de la PAM entre les LDCV et la surface cellulaire. L’approvisionnement en ascorbate réduit dans les LDCV est maintenu par le cytochrome B561, une protéine qui possède cinq domaines transmembranaires et fait la navette entre les électrons de l’ascorbate cytosolique et l’ascorbate dans la lumière des LDCV. Le cytochrome B561 est également présent dans les vésicules contenant de la catécholamine, où il remplit une fonction similaire pour la DBM (voir chap. 12). Les tissus nerveux et endocriniens maintiennent des concentrations d’ascorbate réduit environ 100 fois supérieures à la concentration sanguine d’ascorbate, alors que la plupart des autres tissus ne concentrent pas l’ascorbate.

Plusieurs peptides ont des résidus d’acide pyroglutamique NH2-terminal, également appelés acide glutamique cyclique (<Glu), qui sont essentiels à la bioactivité, par exemple, l’hormone de libération de la thyrotropine (TRH) et l’hormone de libération de la gonadotrophine (GnRH). L’enzyme responsable de cette étape est la glutaminyl cyclase, qui convertit le Gln NH2-terminal d’origine en <Glu. La régulation et la fonction de la glutaminyl cyclase n’ont pas encore été étudiées de manière approfondie. Une autre modification importante mais peu fréquente des peptides est l’α-N-acétylation (figures 18-6 et 18-7). Au cours de la transformation de la POMC, l’α-N-acétylation augmente considérablement le pouvoir de noircissement de la peau de l’ACTH(1-13)NH2 tout en abolissant à la fois le pouvoir stéroïdogène surrénalien de l’ACTH et l’activité opiacée de la β-endorphine . La ou les enzymes responsables de cette modification n’ont pas encore été purifiées ou clonées.

À titre d’exemple, la figure 18-6 montre le schéma des étapes de traitement dans le système POMC . Les étapes endoprotéolytiques initiales (figure 18-6, étapes 1 à 4) sont médiées par la PC1 et se produisent dans tous les neurones et cellules endocrines producteurs de POMC, généralement dans l’ordre numérique indiqué. Il est clair que les étapes 1 et 2 sont initiées dans le réseau trans-golgi et se poursuivent dans les VCDL, tandis que l’étape 4 ne se produit que dans les VCDL. Les étapes 5 à 7 se produisent uniquement dans les VCDL et semblent nécessiter la PC2. Dans l’antéhypophyse adulte, les corticotropes contiennent PC1 mais pas PC2 et n’effectuent que les clivages 1-4. Cependant, au cours du développement postnatal précoce, les corticotropes expriment également PC2 et les clivages 5-7 sont transitoirement observés dans les corticotropes. Chez le rat, l’expression de PC2 et le clivage au sein de l’ACTH (clivage 5) diminuent simultanément quelques semaines après la naissance, à peu près au moment où apparaît le schéma adulte du contrôle de l’ACTH sur la stéroïdogenèse surrénalienne.

Les mélanotropes et les neurones du SNC fabriquant la POMC expriment à la fois PC1 et PC2 et, ainsi, les produits peptidiques plus petits sont observés dans ces cellules. Le PAM est exprimé dans toutes les cellules productrices de POMC, de sorte que l’α-amidation du peptide de jonction (JP), un petit peptide sans fonction biologique claire, se produit rapidement dans toutes les cellules POMC (Fig. 18-6). Dans les mélanotropes de l’hypophyse intermédiaire et les neurones POMC du noyau du tractus solitaire, l’α-N-acétylation de l’ACTH(1-13)NH2 et de la β-endorphine se produit. Dans les mélanotropes, l’α-N-acétylation de l’ACTH peut se produire avant le clivage 5. Comme l’indique la figure 18-4, les clivages particuliers effectués et les modifications apportées aux terminaisons NH2- et COOH des produits peptidiques déterminent le mélange de peptides bioactifs libérés.