Le condenseur – différents types. Contraste dans le microscope
Dans l’article précédent sur l’oculaire, j’ai souligné que l’oculaire était normalement situé de façon à ce que son plan focal avant coïncide avec le plan image primaire (PIP). Le PIP est conjugué avec l’échantillon dans l’ensemble d’imagerie des plans conjugués, et est donc utile pour mesurer les caractéristiques des spécimens microscopiques.
De la même manière, le plan focal avant du condenseur est conjugué avec le plan focal arrière de l’objectif (mais pas avec l’échantillon) dans le train de rayons d’illumination. Le condenseur constitue donc un endroit accessible où nous pouvons modifier ou régler le contraste de l’image en manipulant les rayons lumineux d’éclairage. Ces deux principes découlent de la méthode d’illumination de Köhler, qui a été traitée dans la troisième partie de cette série.
La fonction du condenseur
Le condenseur remplit deux fonctions dans le microscope. Il fournit une zone de lumière uniformément éclairée dans le champ de vision au niveau du plan de l’échantillon et éclaire l’ouverture de l’objectif uniformément avec une lumière d’un angle suffisant mais contrôlable. Deuxièmement, comme mentionné ci-dessus, il fournit un moyen de réguler le contraste (Bradbury & Evennett, 1996). La forme la plus simple de condenseur est le miroir concave, mais il n’est pas utile pour les objectifs supérieurs à NA 0,2 environ. Si votre microscope est équipé d’un miroir et d’une source lumineuse distante, le côté plat du miroir doit être utilisé conjointement avec tout condenseur de sous-stage installé. En effet, à proprement parler, le condenseur doit recevoir un éclairage parallèle et ainsi amener cette lumière à un foyer au plan focal arrière du condenseur (où se trouve l’échantillon).
Types de condenseur
Le type de condenseur le plus utilisé est le condenseur d’Abbe pour la microscopie à champ clair (figure 1a, 1b). Il est constitué de deux ou trois lentilles, et la lentille supérieure à courte focale peut généralement être basculée hors du chemin optique (1a), ou dévissée (1b), afin de remplir le champ de vision avec des objectifs de faible puissance. Ce simple illuminateur suffira pour la plupart des types de microscopie. Il a été conçu à l’origine pour fournir des faisceaux étroits (ou « crayons ») de lumière oblique à partir d’une ouverture placée de façon excentrique dans le plan focal avant du condenseur. La figure 1c montre un simple illuminateur d’Abbe à deux lentilles monté sur un appareil de sous-étage qui pouvait être tourné et déplacé excentriquement pour fournir un éclairage oblique. La figure 1d montre un condenseur de faible puissance conçu pour remplir complètement le grand champ de vision des objectifs à très faible grossissement.
Bien qu’une ouverture numérique puisse être citée pour le condenseur (souvent 0,9 NA pour les condenseurs secs et 1,4 NA maximum pour les types à immersion dans l’huile), ces chiffres ne donnent aucune indication de la NA pour laquelle les rayons éclairants sont corrigés de l’aberration sphérique. Dans de nombreux condenseurs simples, un cône de lumière solide pour un éclairage axial est rarement corrigé de l’aberration sphérique au-dessus de 0,45 NA. Pour un travail de haute qualité, et pour résoudre une structure à la limite de la résolution, les condenseurs doivent être corrigés des aberrations. Les condenseurs entièrement corrigés, comme les objectifs, contiennent de nombreux éléments de lentille et peuvent être corrigés presque au même degré. Le condenseur achromatique-aplanatique (1e) est corrigé à la fois de l’aberration sphérique et de l’aberration chromatique, et doit être utilisé pour les travaux de la plus haute qualité, et la photomicrographie couleur. Les condenseurs aplanatiques sont corrigés pour l’aberration sphérique uniquement.
Les condenseurs dits « universels » (figure 2) sont multifonctionnels. Ils sont constitués d’un disque rotatif portant une sélection de diaphragmes d’ouverture, de filtres, d’arrêts de patch, de plaques de phase ou de prismes de Wollaston pour le contraste interférentiel différentiel (DIC). Cette disposition permet de passer d’une méthode de contraste à une autre de manière pratique et facile. Le diaphragme de fond noir ne fonctionne généralement que jusqu’à NA 0,5 ou plus. Pour l’utilisation d’objectifs de NA supérieur, il faut utiliser un condenseur de fond noir spécialement conçu à cet effet (figure 3). Pour les détails de son utilisation, et d’autres méthodes d’amélioration du contraste, voir Bradbury & Evennett (1996).
Figure 2. Condensateurs universels. L’image centrale montre le couvercle supérieur retiré, affichant le disque rotatif où se trouvent les annuli de phase d’ouverture, les prismes DIC, les arrêts de patch de fond noir, les disques de Rheinberg et les filtres de modulation Hoffman. La plupart des condenseurs universels possèdent un iris d’ouverture pour le travail en champ clair, plusieurs annuli pour le contraste de phase et un arrêt de fond noir pour le fond noir de faible puissance.
Figure 3. Condensateurs à fond noir. 3(a) Condenseur à fond noir sec. 3(b) & 3(c) Condenseurs à fond noir à immersion d’huile. 3(d) Condenseur de fond noir à immersion d’huile réglable ; ce condenseur peut être réglé pour s’adapter à différentes épaisseurs de diapositives, afin de donner une image de fond noir de haute qualité.
Microscopie à lumière transmise et à lumière réfléchie
L’agencement du microscope à lumière transmise exige un condenseur séparé, puisque la lumière est d’abord condensée sur l’échantillon (où la lumière interagit avec la matière), et est ensuite recueillie par l’objectif plus loin le long de l’axe optique.
La situation dans le microscope à lumière réfléchie est différente. Ici, le trajet du rayon est replié autour de l’axe du spécimen où la lumière est réfléchie par sa surface. L’objectif agit comme son propre condenseur, et l’alignement du microscope à lumière réfléchie est très simplifié (voir les diagrammes de rayons dans la partie 2 de cette série). Cependant, il est difficile d’accéder au plan focal arrière de l’objectif (plan focal avant lorsqu’il est utilisé comme condenseur), c’est pourquoi des lentilles supplémentaires sont utilisées pour créer une position où l’image des diaphragmes et des filtres est conjuguée avec le plan focal arrière.
Le système à lumière incidente est très utile pour la microscopie à fluorescence, principalement parce que l’illumination de l’échantillon est simple, qu’il est plus efficace (donnant des images plus brillantes à des grossissements élevés) et que la combinaison avec d’autres méthodes de contraste par lumière transmise est permise.
Figure 4. Illustration d’un épi-illuminateur pour la microscopie à lumière réfléchie
Cet épi-illuminateur comporte deux types d’objectifs à lumière réfléchie montés dans son nez. L’objectif utilisé est conçu pour l’éclairage du sol sombre, tandis que les deux autres objectifs que l’on peut voir pour le travail en lumière réfléchie en champ clair. Les larges colliers autour de ces deux derniers objectifs permettent de centrer l’objectif sur l’axe optique. Le « D » sur le boîtier de l’épi-illuminateur désigne l’insert interchangeable qui permet d’utiliser l’appareil pour l’éclairage en champ sombre. Il peut être remplacé par un miroir plan pour la microscopie à lumière réfléchie en champ clair. Le condenseur de lumière transmise a été retiré du dessous de la platine.
Si l’objectif agit comme son propre condenseur en microscopie à lumière réfléchie, pourquoi les objectifs ne sont-ils pas également utilisés pour l’éclairage en microscopie à lumière transmise ? Outre la difficulté pratique d’accès au plan focal arrière de l’objectif, il est difficile de mettre les objectifs à une utilisation multifonctionnelle, et l’angle d’éclairage n’est généralement pas contrôlable (par un diaphragme d’iris dans le plan focal arrière de l’objectif).
Principes de base de l’amélioration du contraste
Une visibilité suffisante, ou contraste, est nécessaire pour que nous percevions les détails de l’image résolue par nos microscopes. La sélectivité est importante : nous avons besoin d’au moins quelques différences régionales au sein de l’objet, et entre l’objet et l’arrière-plan, pour discerner les détails.
Le contraste dans l’image est obtenu par trois moyens, séparément ou en combinaison. Ce sont :
- l’interaction spécimen-lumière,
- la manipulation de l’éclairage, et
- la manipulation du support d’enregistrement de l’image.
La modification du contraste dans la partie (c) peut être réalisée par le développement photographique et/ou l’impression, et également en utilisant le contraste électronique des images vidéo analogiques ou numériques. Cependant, le condenseur joue un rôle déterminant dans les parties (a) et (b) pour la manipulation du contraste et de la visibilité dans l’image. De plus amples détails sur les aspects théoriques et pratiques des techniques de contraste en microscopie optique peuvent être trouvés dans Bradbury & Evennett, 1996 et Sanderson, 2002, 2000, 1998 et 1994. En bref, les formes les plus connues de génération de contraste sont le champ clair, l’éclairage oblique, le fond noir &Rheinberg, le contraste de phase et le DIC. Il est également possible de combiner ces méthodes avec différentes formes d’illumination (par exemple, lumière polarisée avec Rheinberg, ou contraste de phase par champ lumineux transmis avec fluorescence incidente). L’amélioration du contraste étant très largement sous le contrôle du microscopiste, on ne saurait trop insister sur l’importance d’une utilisation correcte du condenseur.
Le condenseur doit être correctement focalisé (voir partie 3, mise en place du microscope pour l’éclairage de Köhler) afin d’obtenir une image de meilleure qualité. Ceci est vrai quelle que soit la méthode d’amélioration du contraste (champ clair, phase, fond noir) utilisée. L’effet le plus évident d’un condenseur défocalisé en microscopie à champ clair est une perte significative du pouvoir de résolution, ce qui donne une image « pourrie » avec des halos de diffraction autour de chaque point de l’image. Le même résultat se produit si la lentille supérieure (à courte focale) est omise ou laissée retournée lorsqu’un objectif de haute puissance est utilisé, et que le plan focal arrière de l’objectif n’est pas complètement rempli de lumière.
Lorsque la microscopie à contraste de phase est tentée avec un condenseur mal focalisé, l’anneau dans le condenseur ne correspond souvent pas au diamètre de l’anneau de phase dans le plan focal arrière de l’objectif, et toute amélioration du contraste est perdue. Les problèmes de mise au point du condenseur peuvent également entraîner une mauvaise microscopie du fond noir, si l’image de la butée de patch n’occulte pas complètement l’éclairage direct de l’objectif. La prochaine partie de cette série revient à l’objectif, et considère la longueur du tube, et comment déterminer la distance focale, le grossissement, l’ouverture et d’autres paramètres de vos objectifs.
Bradbury S. & Evennett P. J. (1996) Contrast Techniques in Light Microscopy. Bios Scientific Publishers. ISBN 1-85996-085-5
Sanderson, J. B. (1994) Contrast in Light Microscopy : An Overview. Proceedings of the Royal Microscopical Society 29/4:263-270
Sanderson, J. B. (1998) Techniques d’amélioration du contraste pour la microscopie optique en biologie cellulaire : A Laboratory Handbook 2nd Edn. Cellis, J. (ed). (1998) Vol 3 : 15-33, Academic Press. ISBN (ensemble de 4 volumes) 0-12-164725-0 ; vol 3 seulement = 0-12-164728-5
Sanderson, J. B. (2000) The Theory of Contrast Control in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 38:617-627.
Sanderson, J. B. (2002) Practical Control of Contrast in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 39:275-288.