Mikrotvrdost a chemické složení lidského zubu
Maria del Pilar Gutiérrez-SalazarI, II; Jorge Reyes-GasgaI*
ABSTRACT
Tvrdost lidského zubu, skloviny i dentinu, byla měřena na různých místech pomocí Vickerova diamantu. V této práci ukazujeme, že tyto hodnoty jsou téměř konstantní po celé tloušťce skloviny a dentinu. Indukce byly prováděny od vnějšího povrchu skloviny k vnitřní vrstvě dentinu, přičemž procházely spojením skloviny a dentinu, a to jak u příčných, tak u podélných vzorků. Geometrická rovnoměrnost dobře tvarovaných vtisků byla kontrolována světelným i rastrovacím elektronovým mikroskopem a chemické složení zubu bylo analyzováno charakteristickou rentgenovou energiově disperzní spektroskopií. Naměřené hodnoty tvrdosti se pohybovaly v rozmezí 270 až 360 VHN pro sklovinu a 50 až 60 VHN pro dentin. Cervikální zóna v podélném řezu vykazovala nejnižší hodnotu, zatímco v příčných řezech nejvyšší. Všechny hodnoty tvrdosti byly staticky významné. Výsledky prohlídky naznačují, že rozdíl mezi tvrdostí skloviny a dentinu nesouvisí s obsahem Na, Cl a Mg, ale s procentuálním zastoupením organických a anorganických materiálů ve sklovině a dentinu.
Klíčová slova: mikrotvrdost, chemické složení, lidský zub, sklovina, dentin
1. Úvod
Zubní sklovina je nejvíce mineralizovanou tkání lidského těla. Její složení tvoří 96 % hm. anorganického materiálu a 4 % hm. organického materiálu a vody. V dentinu představuje anorganický materiál 70 % hm. Tento anorganický materiál je tvořen především fosforečnanem vápenatým příbuzným hexagonálnímu hydroxyapatitu, jehož chemický vzorec je Ca10(PO4)6-2(OH) 1. Analýza skloviny a dentinu pomocí rentgenové energiově disperzní spektroskopie (EDS) ukázala rovněž přítomnost dalších prvků, jako je Na, Cl a Mg, v malém množství 2 .
Lidské zuby jsou při žvýkání vystaveny různému tlaku od bodu k bodu. Proto je studium a analýza jejich tvrdosti velmi důležité pro pochopení toho, jak je žvýkací napětí rozloženo v celém zubu, a pro předpověď toho, jak se napětí a deformace mění v důsledku výplňových postupů, věku a onemocnění zubů. Hodnoty tvrdosti lze navíc vztáhnout k dalším mechanickým vlastnostem, jako je Youngův modul a mez kluzu3,4. Měření tvrdosti zubu však není snadné. Vzhledem ke strukturám, které sklovina2 a dentin představují, hranoly vybíhající od sklovinně-dentinového spojení (EDJ) k povrchu v případě skloviny a heterogenní kompozitní materiál v případě dentinu5-7 , je snadné si představit, že jejich hodnoty tvrdosti se liší, a to i od jednoho místa k druhému uvnitř samotné skloviny a dentinu; a že budou chemicky závislé.
Zkoušky tvrdosti mají spolu s intraorálními modely velký význam při de- a remineralizačních experimentech8. Tvrdost lidského zubu byla stanovena různými metodami, včetně abrazivních9, škrábacích10 a vtiskovacích technik3,4,11-14 . Vzhledem k tomu, že u skloviny a dentinu byly zaznamenány značné lokální rozdíly, byly upřednostňovány metody využívající mikroškrábance nebo mikroindentace, přičemž se běžně používá Knoopův diamantový indentor4,8,13,14 . Nedávno byla při měření tvrdosti dentinu popsána nanoindentace pomocí mikroskopie atomárních sil3.
Knoopův (KHN) a Vickerův (VHN) tvrdoměr vykazují přibližně stejné hodnoty15. Průměrná hodnota tvrdosti skloviny a dentinu se pohybuje v rozmezí 270 až 350 KHN (resp. 250 až 360 VHN), resp. 50 až 70 KHN4. Směrodatné odchylky (SD) těchto hodnot však vykazují široké a významné rozdíly, i když u dentinu jsou tyto rozdíly méně výrazné. Tak například Craig a Peyton13 uvádějí pro sklovinu tvrdost v rozmezí od 344 ± 49 do 418 ± 60 VHN; Collys a kol.14 od 369 ± 25 do 431 ± 35; Wilson a Love16 od 263 ± 26 do 327 ± 40. V případě skloviny se tvrdost pohybuje v rozmezí od 344 ± 49 do 418 ± 60 VHN. Mikrotvrdost okluzní skloviny se pohybovala od 359 do 424 VHN a krčkové skloviny od 227 do 342 VHN14. Tyto rozdíly mohou být způsobeny faktory, jako jsou histologické vlastnosti, chemické složení, příprava vzorku a zatížení a chyba odečtu délky vtisku (IL).
U zdravé lidské skloviny bylo zjištěno, že hodnoty tvrdosti, obsahu minerálů a hustoty postupně klesají od vnějšího povrchu směrem k EDJ18-22 . Konkrétněji Kodaka a spol.19 zjistili mírnou korelaci mezi Vickerovou tvrdostí a koncentrací P ve sklovině, ale nízkou korelaci s Ca. Poukázali na to, že hodnoty VHN, Ca a procento P významně klesají ve vnějších, středních a vnitřních místech skloviny. Jiné studie11,19 uvádějí, že vnější povrch skloviny je tvrdší než vnitřní a že tvrdost kontinuálně klesá od vnějšího okraje k EDJ. Gustafson a Kling21 navrhli, že rozdíly v tvrdosti skloviny mohou být způsobeny změnami ve směru vtisku v jednom úseku zubu. Některé další studie13 však nezjistily vůbec žádný rozdíl, pouze nepatrné náznaky, že sklovina je tvrdší v oblasti špičáku a vnějšího povrchu než v oblasti cervikálního okraje nebo EDJ, ale rozdíl byl menší než uváděný SD, a proto nelze učinit jednoznačné prohlášení.
Čísla tvrdosti uváděná pro dentin se rovněž liší. Vzhledem k větší velikosti vtisku ve vztahu k mikrostruktuře dentinu může být tato odchylka způsobena rozdíly v hustotě dentinových tubulů na různých místech. Kenney a spol.3 pomocí modifikovaného mikroskopu atomárních sil k měření tvrdosti dentinu uvedli, že hydratovaný peritubulární dentin má tvrdost uvnitř v rozmezí od 2,2 do 2,5 GPa nezávisle na umístění, zatímco u intertubulárního dentinu tato tvrdost na umístění závisela a byla výrazně větší v blízkosti EDJ (hodnoty od 0,49 do 0,52 GPa) než v blízkosti pulpy (od 0,12 do 0,18 GPa).
Dalším parametrem, který je třeba brát v úvahu, je čas. Bylo zjištěno, že v lidském zubu se vtisky tvrdosti po čase obnovují13,22 . Obecně je však málo známo o tom, jak se velikost těchto vtisků mění s časem. Vzhledem k tomu, že sklovina je poměrně křehký materiál, zdá se, že závislost vtisku na čase je velmi malá nebo zanedbatelná. U dentinu však Herkstroter a spol.22 zjistili, že se vtisky uvolňují (zmenšují) po dobu jednoho dne; poté se vtisky již statisticky nemění. Určitým vysvětlením relaxace vtisku by mohly být rozdíly v obsahu organické matrice a/nebo ve vazbě mezi minerální a organickou matricí.
Jak je vidět, do analýzy tvrdosti lidského zubu je zapojeno příliš mnoho parametrů; proto v této práci získáváme přesné hodnoty Vickersovy tvrdosti (s minimálním SD) pro sklovinu a dentin u zdravých zubů. Při identifikaci a kontrole parametrů, které statisticky ovlivňují měření tvrdosti, jsme dbali na způsob přípravy vzorku, chemické složení po celé délce zubu a relativní orientaci indentoru s hranoly skloviny a tubuly dentinu. Vickersovy indentace tvrdosti byly měřeny a analyzovány pomocí světelné mikroskopie (LM) a skenovací elektronové mikroskopie (SEM).
2. Experimentální postup
Sedm zralých, zdravých premolárů čerstvě extrahovaných z ortodontických důvodů bylo zalito do samotvrdnoucí pryskyřice (obr. 1). Zapuštěné zuby byly rozřezány buď příčně, nebo podélně (obr. 1: a, A2) pomocí frézy s diamantovým kotoučem Whiler Mod. Cutto-1. Tři zuby byly řezány paralelně s okluzní plochou, přičemž byly provedeny řezy v blízkosti 0,5 mm od cuspidu, 1,5 mm v cuspidu, ve střední třetině a v krčkové třetině (obr. 1: c, d, e). Ostatní byly řezány bukolingválně kolmo na meziodistální osu zubu (obr. 1: A1).
Jedním z faktorů, které ovlivňují měření tvrdosti, je preparace vzorku, protože jakýkoli náklon nebo ne rovný povrch by přinesl příliš velkou IL, a tím i menší hodnotu VHN. Proto je při této analýze rozhodující vytvořit rovný povrch vzorků. S ohledem na to byly vzorky postupně leštěny vodou pomocí papírů z karbidu křemíku od č. 1200 do 4000. Konečné leštění bylo provedeno leštícím oxidem hlinitým 0,05 v nízkootáčkové metalurgické leštičce Buehler, mod. Minimet, s malým zatížením vzorku. Poté byly vzorky třikrát po 5 minutách čištěny destilovanou vodou uvnitř na ultrazvukové čističce Bransonic mod. 52.
Měření tvrdosti podle Vickera bylo provedeno mikrotvrdoměrem Matsuzawa mod. MHT2 s diamantovým indentorem na čtvercové bázi s úhlem 136°. Tento tester má světelný mikroskop s vysokým rozlišením a kontrastem se zvětšením 400×. Vtisky byly prováděny rychlostí 20 s sestupně a se zatížením 10 g, 25 g a 50 g; nikdy se nepřibližovaly k žádnému okraji vzorku ani k jinému vtisku. Minimální vzdálenost mezi dvěma po sobě jdoucími vtisky byla větší než 40 mm. Počet vtisků provedených v daném místě zubu závisel na tloušťce skloviny a dentinu na této úrovni. Proto byl tento počet větší v cuspální zóně než v cervikální zóně (obr. 2). Kritériem pro přijetí vtisku byla ostrost diagonálních hran, jednotnost diagonálního tvaru (geometrie) a absence nepravidelností v testovací oblasti. U podélných vzorků byly vtisky prováděny od vnějšího povrchu skloviny k vnitřnímu povrchu dentinu a procházely EDJ v pěti zónách: cervikální, střední třetina, cusp, grove a paralelní s okluzní (obr. 2). U příčných vzorků byly provedeny v bukolinguálním až meziodistálním směru (obr. 1: A2).
Délka os vtisku čtvercového tvaru (IL) byla odečítána buď pomocí mikrometrické stupnice připevněné na okuláru tvrdoměru, nebo pomocí jiného světelného mikroskopu (LM) a pomocí SEM. Hodnota VHN byla získána z tabulek. Pro IL i VHN byla vypočtena průměrná hodnota a SD. K posouzení spolehlivosti chyby pozorovatele při odečítání IL byla použita statistika kappa. Bylo dosaženo hodnoty Kappa 0,90. Aby se snížila chybovost, prováděl odečet stejný pozorovatel. Pro tato pozorování byly použity mikroskopy Zeiss Axiotech LM a Jeol 5200 SEM. Výsledky byly analyzovány porovnáním hodnot délky diagonálního vtisku pomocí analýzy rozptylu ANOVA. Pro chemickou analýzu EDS byl použit SEM Philips XL30 s detektorem NORAN-EDS.
3. Výsledky
Obrázek 3 ukazuje některé hlavní nepravidelnosti vtisku, které vznikají u lidských zubů, pokud některé experimentální parametry nejsou vhodné; jsou známkou toho, že způsob přípravy vzorku nebo zatížení a/nebo poloha vtisku nejsou správné. Kterákoli z těchto nepravidelností neumožňuje správné měření IL, a proto v této práci, pokud byla některá z nich pozorována, nebyl vzorek použit k měření tvrdosti. Ve skutečnosti pozorování kterékoli z těchto nepravidelností stačilo k překontrolování přípravy a experimentálních postupů analyzovaného vzorku.
Obrázek 4 ukazuje tvar vtisku VHN, který pokrývá všechny požadavky na měření tvrdosti. Na obrázku 4a je uveden příklad vtisku vytvořeného přes celou tloušťku zubu v podélném vzorku s hrotem. Obrázek 4b ukazuje některé vtisky vytvořené ve sklovině, zatímco obrázek 4c ukazuje jeden v dentinu. Zvětšení na obr. 4b a 4c je stejné, takže rozdíl v tvrdosti skloviny a dentinu je zřejmý. Obrázek 4 také umožňuje porovnat velikost vtisku s velikostí hranolů skloviny: ukazuje na plochu vtisku 25 mm2.
Aby se předešlo vtisku, jaký je znázorněn na obr. 3, byla zdokonalena metoda přípravy vzorku a byla provedena analýza se zatížením 10 , 25 a 50 g. Na obr. 3 jsou znázorněny vtisky, které vznikly v průběhu analýzy. Průměrné hodnoty IL vzniklých při těchto zatíženích ve stejné zóně a jim odpovídající hodnoty VHN jsou uvedeny v tabulce 1. S přihlédnutím k SD v každém případě je podobnost hodnot VHN v analyzované zóně přímočará. SD pro zatížení 10 a 50 g jsou však větší než pro 25 g.
Collys a kol.14 navrhli pro studium tvrdosti zubu zatížení 50 g, protože podle nich nižší zatížení ovlivňuje velikost vtisku. Pro tento vliv zatížení uvedli dva aspekty: 1) povrch vzorku se během procesu leštění mění a vytváří povlak větší, než je největší dosažená hloubka indentoru, a 2) při nižším zatížení se zvyšuje obtížnost odečítání vtiskových značek. V této práci jsme však po sledovaném způsobu přípravy vzorku nezaznamenali žádnou vrstvu povlaku; přestože je vždy pozorována struktura skloviny a dentinu (obr. 4). Hloubka dosažená použitým diamantovým indentorem se čtvercovou základnou byla přibližně 2 mm. Kromě toho se při zatížení 50 g téměř ve všech vtiscích objevily praskliny a nahromadění materiálu, jako například na obr. 3. Při zatížení 10 g byly vtisky velmi obtížně čitelné.
Hodnoty tvrdosti získané při zatížení 25 i 50 g byly statisticky podobné, ale zatížení 25 g způsobilo méně indikací lomů a lepší tvary vtisku. Proto po analýze tabulky 1 a s přihlédnutím ke všemu výše uvedenému bylo pro měření tvrdosti zvoleno zatížení 25 g. Ojediněle byly pozorovány mírné lomy na vnějším okraji drážkové zóny (zóna 4) a ve střední třetině (zóna 2) v blízkosti vestibulárního povrchu, ale ne v žádné z ostatních zón. Dalším zkoumaným parametrem je doba působení zátěže. McColm23 uvedl, že 15 až 30 s je pro keramické materiály zcela doporučeno. Proto jsme v této studii aplikovali zátěž 25 g po dobu 20 s.
Obrázek 2 ukazuje různé úrovně lidského zubu, na kterých byly provedeny vtisky Vickerovy tvrdosti. Tabulka 2 uvádí hlavní hodnoty VHN získané při zatížení 25 g v různých hodnocených zónách zubu. Z této tabulky vyplývá, že zóna odpovídající příčnému řezu rovnoběžnému s okluzním (zóna 5) vykazovala největší hodnoty tvrdosti, zatímco zóna 1 (cervikální) nejnižší. Všimněte si však, že při zohlednění hodnot SD je rozdíl v tvrdosti mezi zónou 1 a zónou 5 minimální. Tabulka 3 uvádí hlavní hodnoty VHN získané z různých hodnocených zón. Zde pozorujeme, že tvrdost ve sklovině je podle očekávání vyšší než v dentinu, ale zůstává téměř konstantní ve všech tloušťkách skloviny, resp. dentinu. Pouze v blízkosti EDJ je rozdíl, kde se snižuje od hodnoty skloviny k hodnotě dentinu.
Ze získaných dat vyplývá, že zónou s minimální hodnotou VHN byla zóna 2 (střední třetina), zatímco největší byla zóna 5 (paralelní s okluzní). Obecně lze říci, že vtisky ve vzorcích příčného řezu byly lépe čitelné, měly velmi dobrý tvar a minimální lomovou stopu. Naproti tomu v podélném řezu vykazovaly vtisky určité známky lomu, zejména vtisky v zóně 2. Ze statistického hlediska výsledky získané metodou ANOVA ukázaly významné rozdíly (p > 0,05) mezi zónou 5 a ostatními. Z toho vyplývá, že zóna 5 vykazovala významně větší hodnotu tvrdosti, zatímco zóna 1 nejnižší.
Chemická analýza pomocí EDS ukázala, že vztah Ca/P byl větší u skloviny než u dentinu. Ve sklovině byl přibližně 1,63 ve srovnání s 1,67 v čistém hydroxyapatitu; to znamená více Ca než P (tabulka 4). Zjištěny byly také Na, Cl a Mg24 (obr. 5). Obecně lze říci, že ve sklovině Na a Mg vykazovaly minimum na vnějším povrchu skloviny, ale plynule se zvyšovaly až k dosažení EDJ. Ca a P zůstávaly téměř konstantní po celé tloušťce skloviny. Cl byl zjištěn ve vyšší míře na vnějším povrchu skloviny než v EDJ. V dentinu byl zjištěn poměr Ca/P kolem 1,5 (tab. 4); to znamená více P ve sklovině než v dentinu; Cl nebyl přítomen, Mg se zvyšoval od EDJ k vnitřnímu povrchu a Na v těchto místech klesal (obr. 5). Za pozornost stojí také chování C a O: v dentinu je podíl C a O vyšší než ve sklovině. To svědčí o větším hmotnostním procentu organického materiálu v dentinu než ve sklovině, jak je dobře známo.
4. Diskuse
Podle našich výsledků je při studiu tvrdosti zubů Vickerův indentor užitečnější než Knoopův, protože musí být vždy zachován čtvercový tvar; a v blízkosti vnějšího povrchu a EDJ se snadno zjistí malé prodloužení úhlopříček vtisku, které způsobují chyby při měření tvrdosti. Proto navrhujeme, aby se při studiu tvrdosti zubů vždy používal Vickerův indentor.
Statisticky jsme nezjistili žádný signifikantní rozdíl v tvrdosti ve stejné zóně analyzovaných vzorků zdravých zubů, ale pouze mezi různými zónami téhož zubu samotného, podle tabulek 2 a 3. Zjistili jsme hodnoty tvrdosti v rozmezí od 270 do 360 VHN pro sklovinu a od 50 do 60 VHN pro dentin; rozdíly závisí na hodnocené zóně. Tyto výsledky jsou podobné výsledkům, které uvádějí Craig a Peyton13 , ale v našem případě jsou tyto hodnoty VHN konstantní po celé tloušťce skloviny a dentinu pro každou hodnocenou zónu. Závěrem lze říci, že byl pozorován mírný nárůst tvrdosti od zóny 1 k zóně 5; tj. od cervikální zóny v podélném řezu k příčnému řezu, paralelnímu s okluzním.
Někteří autoři21 uvedli určité rozdíly v tvrdosti od vnějšího povrchu zubu ve srovnání s místy v blízkosti EDJ, podobné těm, které jsou uvedeny v tabulce 2, ale také získali, významné přírůstky hodnot SD. Přestože uvádějí větší hodnoty VHN pro vnější povrch než pro EDJ, naznačují stejně jako Gustafson a Kling21 , že tyto rozdíly v tvrdosti jsou způsobeny zvrásněnou strukturou, kterou mají hranoly na vnějším povrchu. V této práci zůstaly statisticky vzato hodnoty tvrdosti podél tloušťky skloviny, resp. dentinu konstantní a změnily se pouze v blízkosti EDJ, a to z přirozených důvodů: před a za EDJ je mezera přibližně 20 mm, kde tvar vtisku vykazuje některé nepravidelnosti naznačené na obr. 3. Na obr. 3 je vidět, že vtisky jsou na povrchu skloviny a dentinu stejné. To dává prostor nižším hodnotám tvrdosti, jaké uvádějí. Tyto hodnoty jsme se rozhodli nezahrnout do našich měření, protože nesplňovaly všechny požadavky, aby mohly být přijaty pro Vickerovu analýzu tvrdosti.
Je zřejmé, že rozdíl VHN mezi sklovinou a dentinem je důsledkem rozdílu v obsahu organických a anorganických materiálů, jak je dobře známo. Podle našich výsledků však VHN zjištěná v samotné sklovině a dentinu není ovlivněna přítomností minoritních prvků Na, Cl a Mg, jak uvádějí někteří autoři18-22 , ale pouze pro procento mineralizace v těchto tkáních.
5. Závěry
Hodnoty tvrdosti zubu podle Vickera nevykazují statisticky žádné změny od vnějšího povrchu skloviny k EDJ a od EDJ k vnitřnímu povrchu dentinu; zůstávají konstantní po celé tloušťce skloviny a dentinu v analyzované zóně. Tvrdost je pouze větší podél příčného řezu než podél podélného řezu a mírně větší od zóny 1 do zóny 5. Rozdíl VHN mezi sklovinou a dentinem je důsledkem procenta mineralizace, které představují.
Poděkování
3. Kinney, J.H.; Balooch, M.; Marshall, S.J.; Marshall. G.W.; Weihs, T.P. Archs Oral Biol., v. 41, s. 9-13, 1996.
4. Meredith, N.; Sherriff, M.; Setchell, D.J.; Swanson, S.A.V. Archs, Oral Biol. v. 41, s. 539-545, 1996.
5. Marshall, G.W. Quintessence Int. v. 24, s. 606-617, 1993.
6. Fosse, G.; Saele, P.K.; Eibe, R. Acta Odontol. Scand, v. 50, p. 201-210, 1992.
7. Garberoglio, R.; Brannstrom, M. Archs Oral Biol., v. 21, s. 355-362, 1976.
8. Stephen, N.; Wei, H.Y.; Koulourides, V. J. Dent. Res., v. 51, s. 648-651, 1972.
9. Taketa, F.; Perdue, H.S.; O’Rourke, W.F.; Sievert, H.W.; Phillips, P.H. J. Dent. Res., v. 36, s. 739-742, 1957.
10. Totah, V.P. J. Dent. Res., v. 21, s. 99-104, 1942.
11. Caldwell, R.C.; Muntz, M.L.; Gilmore, R.; Pigman, W. J. Dent. Res., v. 36, s. 732-737, 1957.
12. Sweeney, W.T. J. Dent. Res., v. 21, s. 303-310, 1942.
13. Craig, R.G.; Peyton, F.A. J. Dent. Res., v. 37, s.661-668, 1958.
14. Collys, K.; Slop, D.; Cleymaet, R.; Coomanss, D.; Michotte, Y. Dent Mater., v. 8, s. 332-335, 1992.
15. Ryge, G.; Foley, D.E.; Fairhurst, C.W. J. Dent. Res. v. 40, s. 1116-1121, 1961.
16. Wilson, T.G.; Love, B. Am. J. Orth. and Dentofacial Orthop, v. 107, s. 379-381, 1995.
17. Gaspersic, D. J. Oral Pathol. Med., v. 24, s.153-158, 1995.
18. Robinson, C.; Weatherell, J.A.; Hallsworth, A.S. Caries Res., v. 15, s. 70-77, 1981.
19. Kodaka, T.; Debari, K.; Yamada, M.; Kuroiwa, M. Caries Res., v. 26, s. 139-141, 1992.
20. Davidson, C.L.; Hoekstra, I.S.; Arends, J. Caries Res., v. 8, s. 135-144, 1974.
21. Gustafson, G.; Kling, O. Odontol. Tskr., v. 56, s. 23-30, 1948.
22. Herkströter, F.M.; Witjes, M.; Ruben, J.; Arends, J. Caries Res., v. 23, s. 342-344, 1989.
23. McColm, I.J. Introduction and overview in ceramic hardness, Plenum Press, New York, 1990.
24. Robinson, C.; Weatherell, J.A.; Hallsworth, A.S. Caries Res., v. 15, s. 70-77, 1981.