K pochopení funkce neuronů obsahujících katecholaminy nám pomohly neuroanatomické metody vizualizace těchto neuronů

Před téměř dvaceti lety Falck a Hillarp využili skutečnosti, že v přítomnosti formaldehydu katecholaminy cyklizují za vzniku intenzivně fluoreskujících produktů . Pomocí fluorescenčního mikroskopu bylo možné zviditelnit neurony obsahující katecholaminy v tenkých řezech získaných z tkáně předem vystavené formaldehydovým parám. Modifikace metody využívá kyselinu glyoxylovou a vedla ke zvýšení citlivosti a stabilnějšímu fluoroforu pro ještě lepší vizualizaci jemných axonů a terminálů.

Po purifikaci enzymů syntetizujících katecholaminy bylo možné vyvolat antiséra proti každému enzymu a lokalizovat enzym pomocí imunocytochemie. Tenké řezy tkání lze inkubovat s protilátkou proti určitému enzymu, například králičí anti-DBH, a poté inkubovat s druhou protilátkou spojenou s markerem, například fluoresceinem nebo křenovou peroxidázou. Tyto markery lze snadno vizualizovat a zkoumat mikroskopem. Pomocí této techniky lze odlišit neurony obsahující PNMT, které syntetizují adrenalin, od noradrenergních neuronů bez PNMT; podobně lze oddělit noradrenergní neurony obsahující DBH od neuronů obsahujících DA, které tento enzym nemají. Klonování genů, které kódují katecholaminergní biosyntetické enzymy, umožňuje použít in situ hybridizaci k lokalizaci mRNA v rámci konkrétních neuronů.

Nakonec bylo experimentálně využito vysoce selektivního procesu vychytávání katecholaminů. Po inkubaci s radioaktivním NE tak lze pomocí autoradiografických technik prokázat noradrenergní axony na ultrastrukturální úrovni. Případně po podání kongeneru 5-hydroxydopaminu, který je aktivně vychytáván a ukládán ve vezikulách, lze terminály obsahující katecholaminy rozlišit podle přítomnosti hustých precipitátů 5-hydroxydopaminu v jejich vezikulách. V imunocytochemii byly rovněž použity protilátky proti transportérům a jejich mRNA byla zmapována pomocí hybridizace in situ. Tyto studie obecně potvrzují výsledky dřívějších studií.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.