Utvärdering av den mikrobiella mångfalden av denitrifierande bakterier i en satsreaktor

BIOPROCESS ENGINEERING

Utvärdering av den mikrobiella mångfalden av denitrifierande bakterier i en satsreaktor

S. I. MaintinguerI,*; I. K. SakamotoII; M. A. T. AdornoII; M. B. A. VarescheII,*

ABSTRACT

Mikrobiologiska samhällen i en industriell anläggning för aktiverat slam kan bidra till denitrifikationsprocessen, men informationen om de mikroorganismer som finns i denitrifikationsreaktorer är fortfarande knapp. Avlägsnande av oorganiska kväveföreningar kan åstadkommas genom tillsats av kolkällor till den biologiska processen för denitrifikation. Etanol är ett ekonomiskt lönsamt alternativ som kolkälla i tropiska länder som Brasilien, med storskalig produktion av sockerrör. I denna artikel rapporteras om en framgångsrik applicering av aktivt slam med nitrat och etanol i en anaerob reaktor. Verksamheten pågick under 61,5 timmar med total förbrukning av nitrat under 42,5 timmar, nitritgenerering (2,0 mg/L) och etanolförbrukning (830,0 mg/L) under 23,5 timmar. Antalet denitrifikationsceller enligt det mest sannolika antalet i början av driften var lägre än i slutet, vilket bekräftar att inokulumet från aktivt slam kan användas för denitrifikationsprocessen. Proverna från celltalen identifierades som Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Comamonas sp. och okultiverade bakterier. Dessa arter kan därför vara inblandade i nitratreduktionen och etanolförbrukningen i satsreaktorn.

Nyckelord: Aktiverat slamsystem; Acidovorax; Acinetobacter; Nitrat; Etanol.

INLEDNING

Mikroorganismer med förmåga till denitrifikation är vitt spridda i naturen: jord, sediment, sötvatten, hav och reningssystem för avloppsvatten (Park & Yoo, 2009).

Många inokula från hushålls- och industriella avloppsreningsverk kan innehålla denitrifikationsbakterier, främst i aktiverade slamsystem (Liu et al., 2006; Daniel et al., 2009), där det biologiska kväveavskiljandet sker för att främja denitrifikation, dvs. under heterotrofa anoxiska förhållanden agerar de organiska kolkällorna som elektrondonatorer och reducerar nitrat till kvävgas (Canto et al., 2008). Närvaron av organiska kol- och energikällor är nödvändig för heterotrofisk denitrifikation (Nava et al., 2010).

De flesta av de denitrifierande bakterierna omfattas av proteobacteria phylum, bland annat Acidovorax, Comamonas och Acinetobacter. Sådana bakterier kan förekomma vid avfallsbehandling, särskilt i aktiverade slamsystem, som kan bilda molekylärt kväve från nitrat och en exogen kolkälla, t.ex. etanol. Den fullständiga denitrifikationen, dvs. omvandling av nitrat till kvävgas, förmedlas av bakteriearter som normalt använder syre från luften som energikälla (aerob respiration), men de har också förmågan att använda nitrat och nitrit i stället för syre (anoxiskt tillstånd). Dessa bakterier kan alltså växa aerobt i frånvaro av nitrat eller under anoxiska förhållanden i närvaro av nitrat. Omvandlingen av nitrat till molekylärt kväve kallas också för anoxisk respiration (Park & Yoo, 2009).

En mängd olika organiska föreningar har använts, till exempel metanol, etanol, glukos, acetat, aspartat eller myrsyra och aromatiska föreningar (Queiroz et al., 2011). Den största delen av den publicerade forskningen om denitrifikation av dricksvatten omfattar dock användning av metanol, etanol och ättiksyra (Park & Yoo, 2009). Etanol (Daniel et al., 2009), glukos och acetat är några av de externa elektrondonatorer som framgångsrikt använts för denitrifikation. Särskilt i Brasilien är etanol ett möjligt alternativ (Gavazza dos Santos et al., 2004). Etanol produceras i stor skala i Brasilien sedan 1975 genom det nationella alkoholprogrammet (1975-1985). Brasilien producerar nästan 2,6 x 108 ton sockerrör som bearbetas av 324 sockerbruk för att producera socker och etanol (Borrero et al., 2003). Det produceras rikligt från sockerrör och kostar vanligtvis mindre än andra bekväma kolkällor. Behovet av ytterligare elektrondonatorkällor för exogen process ökar dock driftskostnaderna, vilket möjligen utgör en nackdel för användningen av innovativ anaerob processbaserad teknik (Gavazza dos Santos et al, 2004).

De stökiometriska förhållanden som beskriver den bakteriella energireaktionen (Park & Yoo, 2009) skrivs som följer, när etanol används som kolkälla:

0,69 C2H5OH + NO3 + H+ → 0.14 C5H7NO2 +0,43 N2 + 0,67 CO2 + 2,07 H2O

Även om denna ekvation avslöjar den stökiometriska mängd etanol som krävs för nitratdissimilation, krävs ytterligare etanol för syrefrihet och cellsyntes. I praktiken används 25-30 % av den etanol som krävs för bakteriecellsyntesen. När det finns löst syre är etanolbehovet motsvarande högre. Därför är ett vanligt arbetsvärde för viktförhållandet mellan substrat och nitrat (C:N03) nästan 3 (Park & Yoo, 2009).

Det finns endast ett fåtal referenser om satsreaktorer och denitrifikationsprocessen. Dessa konfigurationer kan användas för att undersöka näringsbehov (Maintinguer et al., 2008). Denitrifikationsprocessen med komplexa kolhydrater utvärderas i satsreaktorer eftersom det partikulära organiska material som finns i dessa system kan försvåra driften i andra konfigurationer, till exempel med stärkelse (Iamamoto, 2006). Dessutom förblir biomassan kvar i satsreaktorn under alla driftsperioder jämfört med kontinuerliga flödesreaktorer. Dessa fakta kan bidra till den totala nitratförbrukning som verifieras i satsreaktorn (Etchebehere et al., 2001; Gavazza dos Santos et al., 2004).

Nitratavskiljning med aktivt slam-inokulum har studerats särskilt i länder med tempererat klimat. Det finns få rapporter om studier av nitratavskiljning och molekylärbiologi med aktivt slam-inokulum från tropiska länder som Brasilien. Det första syftet med vår studie var därför att utvärdera denitrifikationsprocessen med aktivt slam som inokulum från tropiska klimat. Det andra målet med vår studie var att utföra en mikrobiell karakterisering av inokulumet i syfte att identifiera de potentiella organismer som är specifikt involverade i denitrifikationsprocessen.

Detta arbete studerade den mikrobiella mångfalden av denitrifikation i en satsreaktor som matas med etanol och nitrat med hjälp av tekniker för molekylärbiologi och traditionell metodik för mikrobiologi.

MATERIAL OCH METODER

Batchreaktor

Experimentet utfördes med slam från reningsverkets aktiverade slamsystem vid Volkswagen São Carlos (São Carlos SP – Brasilien).

Batchreaktorerna förbereddes i tre exemplar i Duran®-flaskor på 2 L, där 1 L var reaktionsmedium, 10 % (v/v) inokulum (100 mL/L).

Reaktorerna utsattes för en N2-atmosfär (99,99 %) i 20 minuter efter fördelningen av lösningarna. Därefter täcktes de med butylgummiproppar, lindades in och förvarades vid 25 ºC ± 1 ºC, med omrörning vid 120 rpm som drevs under 61,5 h.

Fysikalisk-kemisk och kromatografisk analys

De totala flyktiga torrsubstanserna (TVS) och nitratförbrukningen bestämdes enligt APHA, 2005, spektrofotometriskt. Nitritanalysen utfördes genom flödesinjektion (FIA APHA, 2005). De flyktiga fettsyrorna och alkoholerna bestämdes genom gaskromatografi i en Shimadzu GC-2010, utrustad med en flamjoniseringsdetektor, autosampler för headspace COMBI-PAL – AOC modell 5000 och HP-INNOWAX-kolonn (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm filmtjocklek), enligt Maintinguer et al, 2008).

Kvantifiering av denitrifierande bakterier

Det mest sannolika antalet (MPN) av denitrifierande bakterier utfördes vid fem gånger utspädningen i början och i slutet av driften av satsreaktorn, enligt Tiedje (1982), anpassat för flytande prover. Cellräkningen enligt MPN-metoden gjordes efter 15 dagars inkubation, enligt APHA (2005). Kulturmediets sammansättning och de nitrat- och etanolkoncentrationer som användes i MPN-testerna liknade dem som användes i satsreaktordriften, som tidigare nämnts.

Molekylärbiologi

Proverna för analys av 16S rRNA erhölls från de högsta positiva utspädningssiffrorna (MPN) av denitrifikationsbakterier i slutet av testet från satsreaktorerna.

Totalt genomiskt DNA från proverna erhölls efter celllys med glaspärlor (Sigma) och extraktion med fenolklorform enligt tidigare beskrivning av Griffiths et al. (2000) modifierad.

Amplifieringen genom polymeraskedjereaktion (PCR) utfördes med en bakteriedomänprimeruppsättning för 16S rRNA-genen, 27 framåt (5′-AGAGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′) och 1100 bakåt (5′-AGGGTTTTGCGCTCGTTG-3′) (Lane, 1991). PCR-amplifieringen (Thermo cycler Eppendorf AG – Hamburg 22,331) utfördes med inledande denaturering vid 94 ºC i 5 minuter följt av 30 cykler med denaturering vid 94 ºC i 45 sekunder, glödgning vid 55 ºC i 45 sekunder, förlängning vid 72 ºC i 1,45 minuter och slutlig förlängning vid 72 ºC i 7 minuter och kylning vid 4 ºC.

Prover av PCR-produkter (Polymerase Chain Reaction) (16S rRNA) klonades in i plasmidvektorn pGEM (Promega Easy Vector System I) enligt tillverkarens specifikationer. Klonerna valdes slumpmässigt ut och amplifierades genom PCR. Sekvensering av nukleotider utfördes på en automatiserad ABI 310 PRISM-sekvensator (Dye terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, USA) i enlighet med tillverkarens anvisningar med hjälp av en M13 forwardprimer (50-GTAAAA CGA CGG CCG CCA G-30) (Messing, 1983). PCR-amplifieringen (Thermo cycler Eppendorf AG Hamburg 22, 331) utfördes med inledande denaturering vid 94 ºC i 2 minuter följt av 25 cykler med denaturering vid 94 ºC i 1 minut, glödgning vid 55 ºC i 1 minut, förlängning vid 72 ºC i 1 minut och slutlig förlängning vid 72 ºC i 7 minuter och kylning vid 4 ºC.

Nukleotidsekvenserna bearbetades och de anpassades med programmet Seqman (Lasergene DNAstar-paketet) för att ta bort signalerna från vektorn och baser av låg kvalitet. De anpassade sekvenserna bestämdes med hjälp av sökprogrammet BLAST på NCBI:s webbplats och jämfördes med 16S rRNA-genens organismsekvenser som finns representerade i databasen Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) och Ribosomal Data Base Project (http://rdp.cme.smu.edu). Det fylogenetiska trädet konstruerades med hjälp av Neighbor-Joining-metoden (Saitou & Nei, 1987) med hjälp av programmet MEGA version 4.1 (Kumar et al., 2008). Bootstrap resamplinganalys för 1000 replikat utfördes för att uppskatta förtroendet för trädens topologier. De kända sekvenserna av Aspergillus niger (FJ828924.1) lades till och användes som out-group.

RESULTAT OCH DISKUSSION

Nitratet förbrukades fullständigt efter 42,5 timmars drift (figur 1). Nitritbildningen minskade (2,0 mg/L vid 18,5 timmar) och inträffade efter 23,5 timmars drift. 1,06 g etanol/L (36 % förbrukning) observerades efter 13,5 timmars drift för en ursprunglig koncentration på 1 650 mg/L. Etanolförbrukningen i slutet av försöket var 54 % (0,77 g/L på 61,5 timmar). Dessa resultat var nästan desamma som i Gusmão et al. (2006). Författarna (op.cit.) observerade 98,9 % av nitratförbrukningen under 14 timmars drift, med renade celler av granulärt slam från ett anaerobt slamtäcke med uppåtgående flöde (UASB) som behandlar avloppsvatten från ett slakteri för fjäderfä (DAKAR-Tietê SP Brasilien), med nitrat (350 N-NO3 mg/L), etanol (377 mg/L) och bensen (10 mg/L) som kolkällor.

Metanol (197,78 mg/L) och n-butanol (23,50 mg/L) upptäcktes i början av försöket. Dessa alkoholer (metanol och n-butanol) fanns eventuellt i inokulumet. Koncentrationen av alkoholerna uppvisade liten variation fram till slutet av försöket, vilket tyder på att de inte förbrukades under detta denitrifikationstillstånd (figur 2).

Den maximala genereringen av ättiksyra var 16,7 mg/L vid 61,5 timmars drift. Värdena för STV i början och i slutet av driften av satsreaktorn var 5,14 g/L respektive 11,40 g/L, vilket tyder på en ökning av biomassan med 122 %. Dessa resultat visade att de driftsförhållanden som ålades satsreaktorn gynnade utvecklingen och permanentningen av bakteriekonsortiet under denitrifikationsförhållanden.

I den här studien observerades processen för denitrifikation, vilket också beskrevs av andra författare som använde sig av olika konfigurationer för reaktorerna.

Callado & Foresti (2001) använde anaeroba reaktorer som matades med syntetiskt substrat som simulerade hushållsavloppsvatten för att avlägsna den största fraktionen av kolsubstans och för att främja substratets nitrifikation, denitrifikation och biologisk fosfatavskiljning i samma batchcykel, i en sekventiell anaerob/aerob/anaerob batchreaktor. Systemet drevs i 41 dagar med 84 cykler om 12 timmar vid en temperatur på 28±1 ºC. Författarna (op.cit.) observerade att denitrifikationen skedde under omväxlande aeroba och anoxiska förhållanden i reaktionsfasen. Båda processerna inträffade endast när natriumacetat (500 mg/L) tillsattes i början av den anoxiska fasen.

Etchebehere et al. (2001) testade acetat (40 mmol/L) och glukos (13 mmol/L) som kolkällor för denitrifikation i en anaerob satsreaktor med kaliumnitrat (20 mmol/L) för tre olika inokula: slam från en anoxisk reaktor (laboratorieskala) för att avlägsna kol och kväve från perkolatet från en sanitär deponi; slam från en metanogen reaktor från UASB där man behandlade malt och slam från en anoxisk reaktor som matades med acetat och nitrat. Nitrat förbrukades fullständigt från de tre testade slamproverna, vilket observerades i denna studie. Författarna (op. cit.) drog slutsatsen att acetat är en bättre kolkälla än glukos.

Gavazza dos Santos et al. (2004) studerade denitrifikationsprocessen som utfördes i satsreaktorer som matades med syntetiskt avloppsvatten som simulerade nitrifierat avloppsvatten från reningsverk för hushållsavloppsvatten, med hjälp av tre elektrondonatorkällor: metanol (53,3 mg/l), etanol (38,3 mg/l) och metan (förutom det syntetiska avloppsvattnet). Författarna (op.cit.) konstaterade att den mest effektiva elektrondonatorn var etanol, som fullständigt avlägsnade nitrit och nitrat, vilket observerades i detta arbete.

Iamamamoto (2006) uppnådde en kväveavskiljning på mer än 84 % i en sekventiell satsreaktor som matades med stärkelse och ammonium under omväxlande anoxiska och aeroba förhållanden (2 timmar/2 timmars cykler) och 2 mg O2/L för följande koncentrationer: 125 mg N-NH4/L och 0,95 g stärkelse/L, 250 mg N-NH4/L och 1,9 g stärkelse/L, 500 mg N-NH4/L och 3.8 g stärkelse/L, med inokulum från ett aktiverat slamsystem i ett reningsverk (Flores da Cunha Rio Claro SP Brasilien). Etanol (1 500 mg/L) testades också som kolkälla tillsammans med 500 mg NH4-N/L. Författarna (op.cit.) observerade att avlägsnandet av nitrit och nitrat var fullständigt (100 %), vilket också observerades i denna studie, vilket visar att det är möjligt att använda etanol i denitrifikationsprocessen.

Det denitrifierande cellantalet i MPN i början av driften av satsreaktorn var lägre (1,1 x 1010 MPN/mL) än i slutet av driften (1,2 x 1019 MPN/mL) (figur 3). Dessa resultat är högre än de som rapporteras i litteraturen och som beskrivs nedan.

Etchebehere et al. (2001) räknade denitrifierande celler enligt det mest sannolika antalet (MPN) i ett basmedium som kompletterades med jästextrakt (0,5 g/L), kaliumacetat (1,84 g/L) och kaliumnitrat (0,72 g/L) och erhöll 9,6 x 106 MPN/mL med slam från den anoxiska reaktorn i ett lakvattenbehandlingssystem. Callado och Foresti (2001) använde natriumacetat som kolkälla i en sekventiell anaerob/ aerob/anaerob satsreaktor och fann fler MPN denitrifikationsbakterier i början av verksamheten (2,5 x 106 MPN/mL) än i slutet (3,5 x 105 MPN/mL). Författarna (op.cit.) drog slutsatsen att denna minskning inte påverkade denitrifikationsprocessen.

Iamamamoto (2006) fick samma storleksordning i MPN av denitrifikationsbakterier i slutet av driften av en sekventiell satsreaktor med 250 mg N-NO3/L (3,9 x 106 MPN/mL) och 500 mg N-NO3/L (1.1 x 106 MPN/mL), båda med tillsats av stärkelse (1 900 mg/L) som kolkälla och inokulum från aktiverat slam från ett avloppsreningsverk (Rio Claro SP – Brasilien).

De denitrifierande bakterierna gynnades av de näringsförhållanden som rådde i den anoxiska reaktorn. Detta faktum bekräftade förmågan hos inokulumet från aktiverat slam för denitrifikationsprocessen.

Femtio kloner erhölls från det analyserade provet för kloning och sekvensering av 16S rRNA-genfragmenten från det mikrobiella konsortiet. Kloner med värden på mindre än 180 nukleotider införlivades dock inte i den fylogenetiska analysen eftersom de inte var tillräckliga för att kunna jämföras med den databas som beskrivs nedan. Sekvenserna från kloning och sekvensering erhölls från det MPN-positiva provet med högsta spädning (10-18) (tabell 1).

Acinetobacter sp. identifierades med likheterna: 98 % (kloner 1, 8, 13, 15, 33, 43, 45, 52, 54, 62, 67, 83 och 2, 4, 18, 20, 23 och 27) och 99 % (kloner 6, 15, 16, 37 och 38). Det är en gramnegativ bakterie som inte är rörlig, oxidasnegativ, icke-fermentativ, i par och tillhör stamgruppen Proteobacteria Phylum, familjen Moraxellaceae. Det är en viktig mikroorganism i marken, där den kan bidra till mineralisering av till exempel aromatiska föreningar (Geng et al., 2006). Wang et al. (2007) isolerade Acinetobacterstammar i ett prov från ett aktiverat slamsystem (Jizhuangzi Tianjin – Kina). Denna stam kunde biologiskt bryta ned fenol (1,1 g/L) genom fria och immobiliserade celler. Geng et al. (2006) isolerade fenolnedbrytande bakterier i ett prov från ett system för behandling av aktivt slam (Singapore). Biokemiska tester visade att dessa mikroorganismer kan växa i närvaro av etanol, glukos, sackaros och aromatiska föreningar som toluen, fenol och bensoat. Den beskrevs som en ny art, Acinetobacter EDP3. Författarna (op.cit.) drog slutsatsen att denna art kan användas för att avlägsna fenolföreningar eller för bioremediering in situ av fenol i jord. Cai et al. (2009) identifierade 58 resistenta bakterier från jord som förorenats av arsenik. Stammarna Acinetobacter, Agrobacterium, Arthrobacter, Comamonas, Rhodococcus, Pseudomonas och Stenotrophomonas identifierades i höga koncentrationer (20 mM Ar/L). Acinetobacter sp. som identifierades i detta arbete växte på grund av de operativa förhållandena och kan bidra till denitrifikation.

Kloner 24 och 26 liknade Comamonas sp. med likheter på 98 % respektive 97 %. Comamonas är gramnegativa bakterier som tillhör Fylum proteobacteria och familjen Comamonadaceae. Etchebehere et al. (2001) isolerade gramnegativa denitrifierande bakterier från en anoxisk reaktor som användes för behandling av lakvatten från deponier i Montevideo (Uruguay). Den isolerade arten hade likheter med Comamonas terrigena. Denna mikroorganism betraktades dock som en ny art som fick namnet Comamonas nitrativorans. Den beskrevs som en gramnegativ bakterie med rörliga polära flageller, aerob och kemoorganotrof. Denna art växte i etanol, acetat och butyrat, nitrat, nitrit och kan reducera nitrat till N2.

Därmed fanns de Comamonas-arter som identifierades i den här studien i inokulumet av aktiverat slam och kunde bidra till den denitrifikation som skedde i testerna.

Klonerna 25, 28, 34, 36, 42 och 65 liknade Acidovorax sp. med likheter på 99 % respektive 97 % (tabell 1). Acidovorax sp. hör till proteobakterierna och är lätt att hitta i aktiverade slamsystem. Många Acidovorax-arter fungerar som reglerande mikroorganismer i mikrobiologiska behandlingsprocesser i aktiverade slamsystem. Flera Acidovorax-arter används för biologisk nedbrytning av plast och för att avlägsna andra organiska föroreningar, inklusive nitrofenoler, nitrobensen och polyklorerade bifenyler genom denitrifikation (www.cebl.autokland.ac.nz/ecogenomics/index.html). Khan et al. (2002) isolerade denitrifierande bakteriearter som bryter ned PHBV (poly-3-hydroxibutyrat-co-3-hydroxivalerat) från tre aktiverade slamsystem som används för att behandla kommunalt avloppsvatten (Nagoya, Osaka och Toyohashi – Japan). De 37 kloner som analyserades visade likhet med organismer som tillhör klassen betaproteobakterier. De flesta kloner visade likhet med Acidovorax-arten, vilket bekräftar att denna art var inblandad i nedbrytningen av PHBV under denitrifierande förhållanden. Gentile et al. (2007) isolerade liknande arter som Acidovorax, Delftia acidovorans, Pseudomonas, Chryseobacterium och Achromobacter från en denitrifikationsreaktor som drevs med etanol (40,0 g/L) och mjölksyra (40,0 g/L) som kolkällor; de testade elektrondonatorer separat och nitrat (1,9 g NaNO3/L; 2,3 g KNO3/L) användes som kvävekälla. Författarna (op. cit.) drog slutsatsen att fullständig nitratreduktion till N2 utfördes av Acidovorax-arter, medan Achromobacter sp. och Delftia acidovorans var ansvariga för ofullständig nitratdenitrifikation till nitrit. Acidovorax-arter fanns därför i de prover som analyserades i den här studien och de kan vara inblandade i den denitrifikation som skedde i satsreaktorn.

Unkultiverade bakteriestammar från Rhodocyclaceae-familjen identifierades med 98 % likhet (klon 9 – AY945917.1 och klon 46, 84 AY945905), vilket framgår av tabell 1. Medlemmarna i Rhodocyclaceae-familjen är gramnegativa bakterier som tillhör klassen Betaproteobacteria. De är denitrifierande aeroba stavar med mångsidig metabolisk kapacitet. De flesta arter lever i akvatiska livsmiljöer och oligotrofa markförhållanden. Många av dem förekommer i avloppsvatten och spelar en viktig roll i den biologiska saneringsbehandlingen av sådana platser (http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodocyclaceae). Liu et al. (2006) har försett en denitrifikationsreaktor med kinolin (40 mg/L), en giftig amin som används vid tillverkning av färgämnen, bekämpningsmedel och syntetiska bränslen, glukos (180 mg/L), nitrat och kaliumfosfat (C/N/P på 150:30:1). Inokulumet kom från den andra sedimenteringstanken i avloppsreningssystemet vid Industry Shanghai Coking & Chemical Factory (Wujing, Shanghai – Japan). Quinolinavskiljningen var 90,2 % efter reaktorperioden i stationärt tillstånd (6 veckor). Molekylärbiologiska analyser av inokulum och från denitrifikationsreaktorn visade på okultiverade bakterier, Thauera och Azoarcus i båda testerna. Enligt författarna var andelen kloner som var knutna till bakterier som tillhörde Azoarcus och Thauera 74 % i den denitrifierande reaktorn respektive 4 % i inokulumet. Kunskap om mikroorganismer från miljöprover är beroende av laboratorieförhållanden med rena kulturer (Pace, 1997). Mindre än 1 % av bakterierna från olika ekosystem är dock kända (Amann, 1995), eller ungefär 99 % har inte studerats och identifierats. Därför förväntade vi oss i detta arbete att erhålla liknande sekvenser av okultiverade bakterier.

Det fylogenetiska trädet som erhållits med konsensusprimer för bakteriedomäner i molekylärbiologiska analyser av försöket illustreras i figur 4.

Likhetskoefficienterna mellan de olika grupperna av mikroorganismer var 97 % till 99 % och de indikerade närvaron av fylogenetiskt besläktade arter, baserat på 16S rRNA-genens partiella utvärderingssekvenser. Kända sekvenser av arter var från NCBI-databasen med Aspergillus niger (FJ828924.1) som en sekvens från en utomstående grupp.

Därmed fanns Acidovorax-, Comamonas- och Acinetobacter-arter som identifierades i den här studien i det aktiverade slamsystemet från Volkswagen São Carlos Motors, och de skulle kunna vara inblandade i nitratreduktionen och etanolförbrukningen.

KONKLUSIONER

Potentialen hos inokulum från ett aktiverat slamsystem och användningen av etanol som kolkälla i en denitrifikationsprocess har påvisats i en satsreaktor.

De MPN-värden för denitrifikationsbakterier som erhölls i denna studie, i kombination med resultaten för avlägsnande av nitrat, visade att det fanns denitrifikationsbakterier i inokulumet från ett aktiverat slamsystem, vilka gynnades av de näringsbetingelser som infördes.

De identifierade klonerna hade fylogenetisk tillhörighet till proteobakteriefyllet, klassen Alphaproteobacteria och Gamaproteobacteria, med Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Comamonas sp. och okulturerade bakterier. Dessa bakterier kan vara involverade i nitratreduktionen och konsumtionen av etanol i en anoxisk satsreaktor.

REDOVISNINGAR

Författarna är tacksamma för de bidrag de fått från FAPESP och CNPq.

APHA, AWWA och WEF, Standard methods for the examination of water and wastewater. 22th Edition, American Public Health Association, Washington, DC (2005).

Iamamoto, C. Y., Nitrogen removal in sequencing batch reactor with suspended biomass treating high ammonia concentration wastewater. Doktorsavhandling, University of São Paulo, Brasilien, School of Engineering, University of São Carlos, Brasilien (2006).

Messing, J., Nya M13-vektorer för kloning. Methods in Enzymology, 101 20-78 (1983).

Pace, N. R., A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science, 276, 734-740 (1997).