Efter att ha tagit examen från Southwest Texas State University i San Marcos, Texas, gick Boothe med i Oregon Shakespeare Festivals repertoarsällskap och spelade roller i bland annat Henry IV, del 2 (som Henry IV av England) och Troilus and Cressida. Han debuterade på scenen i New York i Lincoln Center-produktionen av Richard III från 1974. Fem år senare gjorde han sin teaterdebut på Broadway i en huvudroll i enaktspjäsen Lone Star, skriven av James McLure.
Boothe fick första gången nationell uppmärksamhet 1980 när han spelade Jim Jones i CBS-TV-filmen Guyana Tragedy: The Story of Jim Jones. Boothes skildring av den galna sektledaren fick kritikerkommentarer. I Time’s reportage om produktionen hyllades Boothe: ”Det finns en extraordinär prestation. En ung skådespelare vid namn Powers Boothe fångar all karisma och ondska hos ’pappa’ Jim Jones.” Boothe vann Emmy Award för sin roll och slog ut veteranerna Henry Fonda och Jason Robards. När Screen Actors Guild strejkade hösten 1980 var han den enda skådespelaren som gick över strejkvägarlinjen för att närvara vid ceremonierna, och han sa då: ”Detta kan antingen vara det modigaste ögonblicket i min karriär eller det dummaste.”
Boothe spelade Philip Marlowe i en TV-serie baserad på Raymond Chandlers noveller för HBO på 1980-talet. Han medverkade i filmer som Southern Comfort, A Breed Apart, Red Dawn, The Emerald Forest, Rapid Fire och Extreme Prejudice samt HBO-filmerna Into the Homeland och By Dawn’s Early Light. Dessutom medverkade han i CBS-TV-filmen Family of Spies från 1990, där han spelade förrädaren Navy Officer John Walker. Boothe spelade Curly Bill Brocius i den framgångsrika västernfilmen Tombstone från 1993, den illojala högre arméofficeren i Blue Sky (som är en motsats till Jessica Langes Oscarsbelönade prestation) och den ondskefulla terroristledaren i Sudden Death. Han ingick också i de stora ensemblebesättningarna i Oliver Stones Nixon (som stabschefen Alexander Haig) och U Turn (som stadens sheriff).
År 2001 spelade han huvudrollen som Flavius Aëtius, den romerske generalen som hade till uppgift att stoppa Hunnerna-invasionen, i den tv-producerade miniserien Attila. Boothe spelade en huvudroll som bordellägaren Cy Tolliver i HBO-serien Deadwood, och den skumma senatorn Roark i filmen Sin City (2005), samt dess uppföljare Sin City: A Dame to Kill For (2014). Han är rösten till en av karaktärerna i videospelet Area 51 från 2005 och till Gorilla Grodd, den hyperintelligenta telepatiska superskurken i Justice League och Justice League Unlimited. Han gjorde rösten till skurken Kane i videospelet Turok från 2008.
Han var en speciell gäststjärna i 24, där han spelade vicepresident Noah Daniels. Han återkom i prequel till den sjunde säsongen, 24: Redemption. Strax efter att ha tagit rollen som tillförordnad president ses Boothe lämna Air Force Two med F-15-flygplan i bakgrunden. Boothe spelade en nedskjuten F-15-pilot i Red Dawn. I mars 2008 berättade han i en tv-kampanjannons för senator John McCains presidentkampanj.
2012 medverkade Boothe i Joss Whedons The Avengers i en hemlighetsfull roll som en skuggig regeringsöverordnad till S.H.I.I.E.L.D. 2015-16 återupptog han rollen, nu med namnet Gideon Malick, i ABC:s Agents of S.H.I.E.L.D.
Boothe medverkade i miniserien Hatfields & McCoys från 2012 som domaren Valentine ”Wall” Hatfield. Boothe spelade också rollen som Lamar Wyatt i ABC:s musikdramatiska serie Nashville. Boothe lånade också ut sin röst till Hitman: Absolution, ett videospel från 2012 utvecklat av IO Interactive, där han gjorde röst åt karaktären Benjamin Travis.