PMC

Det har tidigare föreslagits att ITS-analys enbart är tillräcklig för artbestämning av orala streptokocker, inklusive de närbesläktade arterna S. mitis och S. oralis. Konserverade enbasdeletioner på två ställen och en total ITS-längd på 246 bp föreslogs vara karakteristiska för S. oralis, medan S. mitis föreslogs sakna deletioner och ha en ITS på 248-249 bp (2, 3). I vår studie fann vi isolat av båda arterna som hade båda deletionerna eller ingendera, tillsammans med överlappande ITS-längder. Isolaten av S. oralis och S. mitis kunde därför inte särskiljas på ett tillförlitligt sätt med hjälp av dessa kriterier. En annan studie har föreslagit att ITS-sekvensanalys, även om den inte är tillräcklig för att skilja S. oralis och S. mitis åt, är tillräcklig för att identifiera många andra orala streptokockarter, inklusive de som tillhör anginosusgruppen (18). Vi fann dock ett isolat av anginosusgruppens art S. intermedius (VMC38) som inte kunde klassificeras med hjälp av ITS (se tabell S1 i tilläggsmaterialet).

Ett stort antal isolat, särskilt för S. mitis och Streptococcus constellatus, hade också identiska sekvenser, vilket omöjliggjorde fylogenetisk analys. Identiska sekvenser erhölls också från fem par isolat som härstammade från samma patienter (data visas inte).

Eftersom ITS-analysen inte var tillräcklig för våra syften sekvenserade vi ett andra gemensamt mål – sodA-genen, som kodar för manganberoende superoxiddismutas (1, 5, 10, 12, 14, 19, 27). Detta gjorde det möjligt att utesluta flera isolat. De stampar som nämns ovan som härstammande från samma personer och med identiska ITS-sekvenser hade också identiska sodA-sekvenser, vilket bekräftade att isolaten var identiska, och ett isolat från varje par uteslöts. Två isolat uteslöts på grund av ett uppenbart misstag i hanteringen av stammarna, och ett annat isolerat behölls inte eftersom ITS- och sodA-sekvenserna visade att det var en stam av Enterococcus faecalis. Ett fylogenetiskt träd som härrör från de återstående isolaten visas i figur 1.

NodA-anpassningen var överlägsen ITS-anpassningen för fylogenetisk analys. De enda isolaten med identiska sodA-sekvenser var två stammar av S. mitis och två stammar av Streptococcus vestibularis. SodA-analysen var också mer användbar för artbestämning. Alla referensstammar var väl åtskilda från varandra i det fylogenetiska trädet. Resultatet var endast fyra tvetydiga artbestämningar för sodA, jämfört med 15 för ITS (se tabell S1 i tilläggsmaterialet). I de fall där en enda artbeteckning överensstämde med både ITS- och sodA-sekvenserna användes den beteckningen. Endast 3 av de slutliga 58 kliniska isolaten kunde inte säkert identifieras med denna metod. Isolaten VMC1 och VMC43 producerade ITS-sekvenser som var för korta för att vara informativa, trots upprepade sekvenseringsförsök, och VMC58 identifierades inkonsekvent genom ITS- och sodA-sekvenser (fig. 1; tabell S1). Vi bekräftade artidentiteten hos dessa isolat med hjälp av en nyligen publicerad databas som innehåller sekvenser av sju hushållsgener från 420 välkaraktäriserade streptokockstammar, inklusive sodA, pfl och pyk (1). Sekvenserna av pfl- och/eller pyk-generna från alla ifrågasatta stammar bestämdes och anpassades till sekvenserna i databasen eMLSA.net (http://www.emlsa.net/), liksom de befintliga sodA-sekvenserna. I samtliga fall stämde pfl- och pyk-artstilldelningen överens med den från sodA. Dessutom visade sodA-anpassningen att VMC58-sekvensen, även om den avviker från typstammen, föll inom ett kluster av 13 Streptococcus infantis-isolat i databasen (data visas inte). Konsensusartidentifieringen av alla isolat som ingick i studien anges i fig. 1 och tabellerna S1 och S2 i tilläggsmaterialet.

Men även om dessa resultat tyder på att sodA-analysen i sig är tillräcklig för att identifiera de flesta stammar, rekommenderar vi att minst en ytterligare proteinkodande hushållsgen inkluderas för alla stammar. Många orala streptokocker är naturligt kompetenta, och fall av förvärv av främmande hushållsgener, inklusive sodA, har rapporterats (1, 12). Detta var inte uppenbart i vår studie, men det fanns exempel på chimära ITS- (VMC38 och VMC50) och sodA-sekvenser (VMC33). I två nyligen publicerade publikationer har man gått längre och föreslagit sekvensering av en annan uppsättning av sju hushållsgener för multilocus-sekvenstypning (7) eller multilocus-sekvensanalys (1). Dessa metoder bygger på analys av ett större antal gener för att ge ökad upplösning och för att minimera effekterna av tillfälliga chimära eller främmande gener (1, 7). Dessa system möjliggör också mer sofistikerade fylogenetiska analyser än vad som är möjligt med endast två eller tre gener. Vi upplevde dock ibland svårigheter vid amplifiering och sekvensering av pfl och pyk och liten framgång med två av de andra rekommenderade generna, map och ppaC (1). I en annan nyligen genomförd studie rapporterades liknande svårigheter (27). Valet av ytterligare gener kan således kräva empirisk prövning, men de som används i analyserna med sju gener bör utforskas först, eftersom stora samlingar av sekvenser från välkaraktäriserade stammar finns tillgängliga för jämförelse (1, 7).

Såvitt vi vet är detta endast den andra rapporten om ett blododlingsisolat av Streptococcus australis (12) eller S. infantis (30). Den enda andra associeringen av den sistnämnda arten med någon sjukdom kommer från två rapporter om dess isolering från sputum hos vuxna med cystisk fibros (17, 26). Det är därför intressant att en vuxen med cystisk fibros var källan till vårt S. infantis-isolat, VMC58 (se tabell S2 i tilläggsmaterialet).

Data om antibiotikakänslighet ingår i tabell S2 och stämmer i stort sett överens med tidigare studier (8). Tabell S2 innehåller också kliniska och demografiska data för källpatienterna, där de kategoriseras utifrån huvudsaklig underliggande sjukdom: medicinsk sjukdom, malignitet, IE eller kirurgi/trauma. Alla IE-ämnen diagnostiserades kliniskt, och alla utom VMC56-fallet (tabell S2) klassificerades som ”definitiv IE” enligt de modifierade Duke-kriterierna (16). Det enda undantaget hade en historia av tidigare IE och användning av intravenösa droger (IVDU), vilket tillsammans med de positiva blododlingarna skulle resultera i en kategorisering som ”möjlig IE”. Uppgifter om möjliga infektionskällor, inklusive centrala slangar, gastrointestinal endoskopi, oral mukosit, tandförhållanden och IVDU, undersöktes också. IVDU hittades för 9 av de 13 IE-patienterna och för endast 1 annan patient i studien (tabell S2). Denna skillnad var statistiskt signifikant (P < 0,0001; Fishers exakta test). Även om den här studien fokuserade på orala arter var alltså IVDU en överväldigande riskfaktor.

Vår fylogenetiska analys avslöjade inga statistiskt signifikanta samband mellan någon särskild art eller klontyp och underliggande sjukdom eller andra kliniska parametrar, inklusive antal vita blodkroppar, högsta temperatur, vegetationsstorlek, påverkad ventil eller patientens död. En tidigare studie innehöll tillräckligt med information för att identifiera arter som isolerats från neutropeniska patienter (12). Våra resultat var liknande, eftersom 11 av 12 isolat i den studien och 9 av 10 i vår (tabell S2) var antingen S. mitis eller den närbesläktade S. oralis. I vår studie var det betydligt mer sannolikt att dessa två arter tillsammans isolerades från neutropeniska patienter än de 12 återstående arterna tillsammans (P = 0,004; Fishers exakta test). Detta kan återspegla prevalensen av dessa arter i munhålan. Det är dock intressant att denna trend inte överfördes till IE. Om man kombinerar våra uppgifter med dem från samma studie (12) för neutropeni och IE isolerades S. oralis och S. mitis från 20 av 22 fall av neutropeni och endast 15 av 27 IE-fall, en skillnad som var statistiskt signifikant (P = 0,01; Fishers exakta test). Liksom i tidigare studier (11, 12, 30) begränsade urvalet vår förmåga att med säkerhet bedöma andra möjliga samband mellan arter och särskilda sjukdomar eller kliniska egenskaper. Genom att para ihop definitiv artidentifiering med kliniska och demografiska egenskaper för varje källpatient (tabell S2) har vi dock försökt göra våra resultat lämpliga för metaanalyser eller andra studier som utnyttjar kombinerade data.