Plaque Assay

Plaque Assay kan användas för att rena en klonal population av virus eller för att bestämma viral titer som plackbildande enheter per ml (pfu/ml) så att kända mängder virus kan användas för att infektera celler under senare arbete. I denna test infekteras cellmonolager med en låg andel virus, så att sporadiska celler infekteras. Ett överdrag av agaros håller cellerna stabila och begränsar spridningen av viruset. När varje infekterad cell producerar virus och så småningom lyseras, blir endast de omedelbart intilliggande cellerna infekterade. Varje grupp infekterade celler kallas en plack. Icke-infekterade celler omger plackarna. Efter flera infektionscykler börjar de infekterade cellerna i plackens centrum att lysera och de perifera infekterade cellerna förblir omgivna av oinfekterade celler. Detta fenomen gör att ljuset som passerar genom de infekterade cellerna bryts annorlunda än de omgivande oinfekterade cellerna, och placken kan visualiseras antingen med blotta ögat eller med ljusmikroskopi. Varje plack representerar ett enskilt virus. Därför kan klonala viruspopulationer renas genom att isolera enskilda plack. Enskilda plack som erhållits från olika utspädningar av en virusstock kan räknas för att bestämma virustitern (pfu/ml) för en viss transfektion eller en viss virusstock. Det är viktigt att cellerna är i gott skick och att de är jämnt fördelade över vävnadskulturplattans yta för att plackanalysen skall lyckas. Cellerna bör vara friska, > 95 % livskraftiga och i log-fas vid tidpunkten för analysen. Klumpiga celler, celler som inte är jämnt fördelade med rätt densitet (>70%) över plattan och celler som inte fäster vid vävnadskulturskålarna inom 30 minuter efter utplacering är skadliga för analysen.

Tillkommande material som krävs:

Plaque Assay Agarose, Cat. nr 554766
Grace’s Unsupplemented Insect Cell Medium
Fetal Bovine Serum
Tissue Culture Dish, 60 x 15 mm, BD Falcon™ Cat. No. 353802
42°C vattenbad

Protokoll

Bestäm antalet plattor som behövs

För varje samtransfektion eller virusstock (och positiv kontroll) gör dubbletter av seriella utspädningar (10 -3, 10 -4, 10 -5, 10 -6 ). Märk varje 60 mm-platta med prov- och utspädningsbeskrivningar.

Sätt ut insektsceller på odlingsplattan

1. Sätt ut 2,3 x 10 6 Sf9-celler på varje 60 mm-platta. Vippa plattorna försiktigt fram och tillbaka och sedan från sida till sida för att jämnt fördela cellerna på plattans yta. Virvla aldrig runt plattan; detta orsakar ojämn cellfördelning. När plattorna har utsatts, låt cellerna fästa i 30 minuter till en timme. Under denna tid kan du förbereda agarlösning och virusutspädningar. Visualisera, genom ljusmikroskopi, för att bekräfta >70 % konfluens och jämn cellfördelning.

Förbered agaroslösning

Plattade celler överlagras med en 1 % agaroslösning i Grace’s Insect Cell Medium kompletterat med 10 % FBS.

1. Först, equilibrera vattenbadet till 42 °C. Bestäm den totala volymen agarlösning som behövs: multiplicera 4 ml/platta med antalet plackanalyser. Av denna totala volym kommer hälften att vara autoklaverad dH 2 O + agaros för att göra en 2 % lösning, och den andra hälften kommer att vara Grace’s Insect Media kompletterad med 10 % FBS. För att bestämma den mängd agaros i gram som behövs för att göra en slutlig 1 % agaroslösning, multiplicera den totala volymen med 0,01. (Till exempel, 10 plattor x 4 ml = 40 ml. 40 ml X 0,01 = 0,4 gram.)
2. Häll lämplig mängd autoklaverad dH 2 O i en steril glasflaska av lämplig storlek. Tillsätt sedan LÄNGT den beräknade mängden agaros, samtidigt som du försiktigt virvlar för att blanda dH 2 O och agaros. Mikrovågsugga blandningen tills den precis kokar. Ta ut flaskan och kontrollera om det finns någon agaros som inte har lösts upp. Om det finns någon, fortsätt värma. Upprepa tills agarosen är helt upplöst (VARNING: Blandningen och den medföljande ångan är mycket het och kan brännas. Använd lämplig skyddsutrustning/försiktighetsåtgärder). När agarosen har lösts upp helt och hållet, sätt löst på flaskan och överför den till vattenbadet på 42 °C. Låt blandningen svalna till 42 °C.
3. Hämta Grace’s Insect Media och tillsätt fetalt bovint serum till 10 %. Exempel: För 100 ml Grace’s Insect Media, tillsätt 10 ml FBS. Placera blandningen Grace’s media + 10 % FBS i vattenbadet vid 42 °C.

Förbered virala serieutspädningar

1. För varje samtransfektion märker du sex sterila 15 ml-rör från 10 -1 till 10 -6 med lämplig provbeskrivning. Tillsätt 2,7 ml TNM-FH-medium till varje rör. Tillsätt 0,3 ml av supernatanten från samtransfektionen till det första röret, vortexa röret. Utför seriella spädningar genom att överföra 0,3 ml till den efterföljande spädningen, använd en ny pipett varje gång.

Infektera monolagsceller

1. I det här skedet har cellerna haft gott om tid att fästa vid plattans yta. Kontrollera flera plattor i ljusmikroskop för att bekräfta 70 % konfluens och jämn cellfördelning.
2. Arbeta med dubblettplattor av varje utspädning, sug försiktigt bort media från cellerna med hjälp av en steril pipettspets på 200 µl och vakuum. Bryt inte upp cellplattan. Tillsätt 1 ml av lämplig virusutspädning till var och en av duplikatplattorna och vagga plattan försiktigt fram och tillbaka och sedan från sida till sida för att fördela viruset jämnt. Upprepa med alla motsvarande plattor och spädningar.
3. Växla försiktigt plattorna vid rumstemperatur, i steril huva var 15:e minut i 1 timme.

Överlagra infekterade celler med agaros

1. Efter 1 timme, bekräfta att agaroslösningen är vid 42°C. Lösningen ska vara tillräckligt varm så att den fortfarande är i flytande tillstånd, men den ska vara tillräckligt kall för att kunna hållas i handen. Om du inte kan hålla flaskan bekvämt är lösningen för varm och kommer att döda Sf9-cellerna. Bekräfta att Grace’s Insect Media w/ 10% FBS är vid 42°C. Om så är fallet, tillsätt en lika stor volym till agaroslösningen för att komplettera den slutliga agarlösningen. Blanda den slutliga agarlösningen väl.
2. När lösningen är klar, placera den i en glasbägare fylld med vatten från vattenbadet. Detta bör hindra lösningen från att stelna medan du använder den under huven. Kontrollera med jämna mellanrum under förfarandet temperaturen på vattnet i bägaren. Om det börjar svalna, ersätt det med varmt vatten från vattenbadet.
3. Arbeta med ett duplikatpar i taget och sug försiktigt bort media från cellerna med hjälp av en steril pipettspets på 200 µl och vakuum. Bryt inte upp cellskiktet. Medan du aspirerar, tippa plattan lätt och dammsug supernatanten från plattans kant. Detta gör det möjligt att suga upp det optimalt utan att störa cellskiktet. Tillsätt därefter långsamt 4 ml agarlösning till varje platta och låt agarn stelna.
4. När agarn på alla plattor har stelnat, placera försiktigt plattorna i en ren, lufttät inkubationskammare. Befukta kammaren genom att placera steril gasväv och 10 ml sterilt vatten i en 10 mm odlingsskål på det nedre hyllplanet i inkubationskammaren. Försegla kammaren och placera den i en inkubator vid 27 °C. Låt plattorna inkubera i 6 – 10 dagar.
5. Plaques kan visualiseras genom att vända plattorna på en mörk bakgrund och belysa dem med en stark ljuskälla från sidan av plattan, eller genom att hålla dem i en 45° vinkel mot en ljuskälla. När du lär dig hur man identifierar en plack, ring runt möjliga plack med en markör. Använd ljusmikroskopet och visualisera med låg effekt för att bekräfta att det finns ett område med ljusning i cellgräset. Visualisera med hög effekt för att leta efter infekterade celler i periferin av ljusningen, sedan mindre infekterade celler när du rör dig bort från området med ljusning.
6. För att underlätta visualiseringen av plack, överlagra med 3 ml 0,5 % agaros (framställd som tidigare beskrivet) som innehåller 50 µg/ml neutralt rött. (Förbered neutral rött (Sigma N7005) som stamlösning på 1 mg/ml i vatten eller PBS. Filtersterilisera och förvara vid 4 °C i mörker). Låt härda och inkubera plattan över natten vid 27°C. Neutralt rött kommer att färga friska celler och placken kommer att synas som tydliga områden, ungefär 0,5 – 3 mm i diameter mot en vit bakgrund. Eftersom neutralt rött är ett vitalt färgämne är det viktigt att färga medan cellmonolaget är friskt, dvs. 4 till 7 dagar efter infektionen.

Plaque Purification from Viral Stock

För att säkerställa en korrekt isolering är det bäst att plack plockas från plattor som innehåller färre än 50 plack. Placera flera spädningar av viruset för att säkerställa att ett tillräckligt lågt antal plack erhålls. Plattor kan tas upp med hjälp av sterila mikropipettspetsar (1 000 µl) eller mikrokapillärrör.

Amplifiera virus från uppsamlade plattor

1. Markera plattan under plattan med en markör. Använd en steril pipettspets och ta bort en agarospropp direkt över placket. Plocka mellan 10 och 100 plack på detta sätt.
2. Placera varje agarospropp i ett separat mikrocentrifugeringsrör som innehåller 1 ml vävnadskulturmedium. Eluera viruspartiklarna ur agarosen genom att rotera röret över natten vid 4 °C.
3. Tillför 200 µl av varje plackplock till separata brunnar i en 12-håls vävnadskulturplatta som såtts med 2 x 10 5 celler per brunn i 1 ml färskt TNM-FH-medium. Inkubera plattorna i 3 dagar vid 27 °C.
4. Virusövervattnet från denna passage 1-stock kan samlas upp och centrifugeras i 5 minuter vid 1 000 x g vid 4 °C för att avlägsna skräp. Förvara vid 4 °C.
5. Sätt en 100 mm vävnadskulturplatta med 5 x 10 6 celler för varje plackisolat. Låt cellerna fästa och byt ut mediet mot 10 ml färskt TNM-FH-medium.
6. Tillägg 200 µl av passage-ett-stocken till 100 mm-plattan och inkubera vid 27 °C i 4 dagar. Spara de återstående 800 µl passage-one stocken vid 4°C som backup.
7. Harva den virala supernatanten och centrifugera för att avlägsna skräp. Bestäm titern för denna passage-två-stock. Om titern förblir under 2 x 10 8 pfu/ml, fortsätt med Baculovirusförstärkning.