Mitokondriell biogenes och metabolisk hyperaktivering begränsar tillämpningen av MTT-analysen vid uppskattning av strålningsinducerad tillväxthämning uppskattning av strålningsinducerad tillväxthämning

Förändringar i strålningsinducerad metabolisk livskraft korrelerar inte med tillväxthämning

Vid studiet av strålningsinducerad tillväxthämning i olika cellinjer med hjälp av MTT-assay och räkning av antalet celler, fann vi att de resultat som erhållits från metabolisk livsduglighet inte korrelerar med det faktiska antalet celler vid olika tidpunkter efter strålningsexponering. MTT-analysen används i stor utsträckning på grund av att den verkligen representerar det livskraftiga antalet celler i ett visst prov2,3,4 . Vi undersökte detta test genom att jämföra MTT-värdena med cellantalet. Exponentiellt växande celler utsattes för joniserande strålning för att analysera tillväxthämning samt metabolisk livsduglighet genom att räkna cellantalet respektive reduktionen av tetrzoliumsaltet till formazan (klassisk MTT-analys; används här som MTT-index). Först utsattes cellerna för olika doser av joniserande strålning (2, 3, 5 och 7 Gy) för att observera de stråldosberoende förändringarna och korrelationen mellan cellantal och metabolisk livsduglighet. Mängden formazan som bildades (dvs. MTT-index) 48 timmar efter bestrålning i alla tre cellinjerna (A549, MDA-MB-231 och HeLa) uppvisade en minskning med 20-35 % (vid 5 Gy och 7 Gy; kompletterande figur 1Ai till Ci) jämfört med obestrålade celler, medan minskningen av antalet celler låg i intervallet 70-90 % (kompletterande figur 1Ai till Ci). 1Aii till Cii), vilket tydligt visar på en brist på korrelation mellan metabolisk livskraft (MTT-index) och tillväxthämning (cellantal) vid alla strålningsdoser; de två analyserade strålningsresponsparametrarna.

För att undersöka generaliserbarheten av denna observation undersökte vi vidare förhållandet mellan förändringar i antalet celler (tillväxthämning) och MTT-index (metabolisk livskraft) i 7 icke-tumorogena och tumorogena cellinjer (NIH/3T3, Raw 264.7, HEK-293, HeLa, A549, MCF-7 och MDA-MB-231) vid en enda dos (5 Gy), som inducerade en nästan 50-procentig tillväxthämning i de tre testade cellerna (kompletterande figur 1). 24 timmar efter bestrålning uppvisade alla utvärderade cellinjer antingen samma värde som kontrollen eller en ökning av MTT-indexet (fig. 1Ai till Gi), utom Raw 264.7 (fig. 1Bi), som är relativt strålningskänslig. Å andra sidan noterades en betydande minskning av antalet celler under dessa förhållanden (fig. 1Aii till Gii). 48 timmar efter bestrålning var cellantalet betydligt lägre, från 43 % (MDA-MB-231, fig. 1Gii) till 76 % (Raw 264.7, fig. 1Bii) jämfört med kontrollen, medan MTT-indexvärdena visade en minskning på endast 10 % till 37 %, med den högsta minskningen i Raw 264.7-cellinjen (fig. 1Bi). När värdena för MTT-index (Δ OD) normaliserades med motsvarande cellantal visade det på 1,4 till 3 gånger (i olika cellinjer) ökad metabolisk livsduglighet per cell (härledd information) vid 24 och 48 timmar, vilket minskade ytterligare vid 48 timmar i de flesta cellinjerna utom Raw264.7, NIH/3T3- och HeLa-cellerna, men förblir signifikant högre än respektive kontroll (Fig. 1Aiii till Giiiii). Dessa observationer visar tydligt att cellantalet, som är det verkliga måttet på strålningsinducerad tillväxthämning och/eller cytotoxicitet, inte korrelerar med den metaboliska livsduglighetsbaserade (MTT) analysen med hög genomströmning, som ofta används för snabb bedömning av strålningsreaktion, vilket tycks bero på den strålningsinducerade förbättrade metaboliska livsdugligheten (Fig. 1Aiii till Giii) hos exponerade celler.

Bestrålningsexponering ökar den metabola livsdugligheten genom att öka mitokondriernas massa

Den ökade metabola livsdugligheten i strålningsexponerade celler kan antingen bero på hyperaktiva mitokondrier eller ökad mitokondriernas massa, eftersom omvandlingen av MTT till formazan huvudsakligen sker i mitokondrier7,8,9,10. Det är känt att joniserande strålning ökar mitokondriernas massa och funktion i exponerade celler20,21. Därför undersökte vi om ökad mitokondriell massa är ansvarig för ökat MTT-index i strålningsexponerade celler med hjälp av flödescytometri. I linje med tidigare observationer fann vi att den genomsnittliga mitokondriella massan per cell ökade signifikant med nästan 1,4 gånger i MCF-7 (minimum, fig. 2Fi) till 4 gånger i Raw 264.7 (maximum, fig. 2Bi) 24 och 48 timmar efter strålningsexponering (fig. 2Ai till Gi). Samtidigt i bestrålade celler observerades också en ökad produktion av formazan per cell vid respektive tidpunkt, som kvantifierades under liknande experimentella förhållanden (fig. 2Aii till Gii). De mikroskopiska bilderna 24 timmar efter strålningsexponering visar också en synligt ökad formazanavlagring i bestrålade celler jämfört med kontrollcellerna (fig. 2Aiii till Giii). De formazanhaltiga kropparna (mitokondrier) i kontrollcellerna är mindre intensivt färgade, sparsamt och jämnt fördelade i cytoplasman, medan de i de strålningsexponerade cellerna var mörkt färgade och samlade i den perinukleära regionen (fig. 2Aiii till Giii). Dessa mikroskopiska bilder ger visuella och stödjande bevis för det högre MTT-indexet eller ökad metabolisk livskraft per cell i bestrålade celler. Vidare bekräftar de hur ett minskat antal bestrålade överlevande celler kan producera en mycket högre mängd formazan (färgtäthet) per cell än respektive obehandlade kontrollceller, vilket resulterar i en felaktig tolkning av data.

Bestrålning ökar den metabola livsdugligheten genom att inducera mitokondriell biogenes

Mitokondrier är den huvudsakliga platsen där MTT reduceras till formazan7,8,9,10, därför kan en ökning av mitokondriell massa öka den metabola livsdugligheten. Den ökade mitokondriella massan i bestrålade celler kan erhållas av två anledningar för det första inducerar joniserande strålning G2/M-blockering22,23 och celler som är arresterade i G2-fasen kommer att ha ett högre antal mitokondrier22,23,24 som kan reducera mer MTT till formazan i bestrålade celler. För det andra är det känt att joniserande strålning inducerar mitokondriell biogenes20,21 , vilket resulterar i ökad mitokondriell massa. För att testa om strålningsinducerat G2/M-stopp eller mitokondriell biogenes eller båda är ansvariga för ökad mitokondriell massa per cell i bestrålade celler undersökte vi båda hypoteserna sekventiellt. Eftersom den strålningsinducerade ökade mitokondriella massan (fig. 2Ai till Gi) observerades i alla cellinjer valdes endast HeLa- och MDA-MB-231-cellerna slumpmässigt ut för att förstå de mekanismer som ligger till grund för den strålningsinducerade ökade metabola livskraften.

Cellcykelfördelningen utfördes 24 och 48 timmar efter strålning. Vid 24 timmar hittades 17 och 6 % överskott av cellpopulationer i G2/M-fraktionen av cellcykeln i HeLa- respektive MDA-MB-231-celler. Blockeringen är emellertid helt upphävd vid 48 timmar (fig. 3A), vilket tyder på att det strålningsinducerade cellcykelstoppet delvis kan bidra till den ökade mitokondriella massan vid 24 timmar men inte vid 48 timmar. Det är också viktigt att notera att ett nästan 17 % ökat antal celler i G2/M-fasen inte kan ge upphov till en 1,9-faldig (vilket är 90 % högt) förändring av mitokondriemassan och en 1,5-faldig förändring av MTT-reduktionen till formazan vid 24 timmar i HeLa-celler (fig. 2Di och Dii). Även om cellcykelblockeringen helt upplöstes vid 48 timmar förblev ändå mitokondriemassan och den förbättrade metaboliska livsdugligheten betydligt högre än de respektive kontrollerna. Dessa observationer stöder inte påståendet att strålningsinducerad ökad metabolisk lönsamhet beror på cellcykelstopp som medierar ökad mitokondriell massa, vilket tidigare rapporterats vid behandling med polyfenolföreningar18,25.

För att testa hypotesen att den strålningsinducerade hypermetaboliska aktiviteten, som korrelerar med ökad mitokondriell massa i exponerade celler (fig. 2Ai till Gi), beror på strålningsinducerad mitokondriell biogenes, analyserade vi mtDNA-kopieringsantalet i kontroll- och strålningsutsatta celler. Kopieringsantalet av Leu t-RNA-genen mättes för det mitokondriella genomet kodade mtDNA-kopieringsantalet och normaliserades med kärnpol-gamma, med hjälp av en semikvantitativ PCR-metod. Både HeLa- och MDA-MB-231-celler uppvisade 18 % och 31 % ökat mtDNA-kopieringsnummer efter 24 timmars strålningsexponering, vilket ytterligare ökar till 138 % i HeLa och förblir 21 % högre i MDA-MB-231 än i kontrollcellerna efter 48 timmar (fig. 3B). Vidare undersökte vi den tidsberoende uttrycksnivån av PGC-1α (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha) och TFAM (Mitochondrial Transcription Factor A) proteiner med hjälp av Western blot. Dessa två proteiner är nyckelregulatorer för mitokondriell biogenes och underhåll i celler26,27,28. Intressant nog observerades en tidsberoende ökning av både PGC-1α- och TFAM-uttrycket (fig. 3C) i celler (HeLa och MDA-MB-231) som exponerats för strålning, vilket korrelerar med ökad mitokondriell massa vid 24 timmars tidpunkt (fig. 2Di och Gi). Vidare kontrollerade vi om den ökade mitokondriella massan är funktionell och har ett ökat uttryck av proteinet SDH-A, som är det primära reducerande enzymet för att omvandla MTT till formazan7,8,9,10. Proteinnivåerna av SDH-A visade sig också öka efter 8 och 24 timmars strålningsexponering (fig. 3C), vilket korrelerar med ökat MTT-index eller ökad metabolisk livsduglighet i HeLa- och MDA-MB-231-celler (fig. 1 och 2). SDH-A-nivåerna konstaterades vara signifikant förhöjda även i andra cellinjer (data visas inte). För att ytterligare bekräfta hypotesen att strålningsinducerad mitokondriell biogenes resulterar i ökad metabolisk livsduglighet inhiberade vi den mitokondriella biogenesen med hjälp av kloramfenikol29,30. Vi fann att kloramfenikol i icke-toxisk koncentration minskade den strålningsinducerade mitokondriella biogenesen avsevärt i båda cellinjerna (fig. 3D) När MTT och tillväxtkinetik (fig. 3E och F) utfördes i celler som behandlades med kloramfenikol före strålningsexponering, visade det sig att det bildades betydligt mindre formazan än vid enbart strålning (fig. 3E), vilket tyder på att den strålningsinducerade förbättrade metabola livsdugligheten huvudsakligen beror på mitokondriell biogenes. Skillnaden mellan den strålningsinducerade tillväxthämningskurvan som erhållits från MTT-analysen och cellräkningen förblir endast 8 % i kloramfenikolbehandlade celler (fig. 3E och F), vilket var 25 % och 33 % i HeLa- och MDA-MB-231-celler (fig. 1Di-ii och Gi-ii), respektive. Dessa resultat styrker hypotesen att strålningsinducerad ökad mitokondriell massa och metabolisk livskraft kommer från strålningsinducerad mitokondriell biogenes i stor utsträckning, som regleras av strålningsinducerad PGC-1α och TFAM.

Bestrålning inducerar hyperaktivering av mitokondrier

I tidigare resultat observerade vi att joniserande strålning inducerar mitokondriernas massa i cellerna, vilket tycks vara ansvarigt för ökad metabolisk livsduglighet (MTT-index) i bestrålade celler; det är dock känt att strålning också inducerar hyperaktivering av enskilda mitokondrier i bestrålade celler31. För att avgöra om det ökade MTT-indexet observerades enbart på grund av ökad mitokondriell massa eller om strålning också inducerade hyperaktivering av mitokondrier, mätte vi ΔΨm (mitokondriell membranpotential, MMP) med fluorescensmikroskopi med hjälp av TMRM. Bestrålade celler (vid 24 timmar) uppvisade ljusröda punkterade mitokondrier som tyder på hög ΔΨm, jämfört med kontrollen (fig. 4A). Detta resultat bekräftades ytterligare genom kvantitativ uppskattning av ΔΨm med hjälp av DiOC6 genom flödescytometri. HeLa-cellerna uppvisade 2,4 till 2,8 gånger ökad MMP, medan MDA-MB-231-cellerna uppvisade 1,3 gånger större förändringar i strålningsinducerad MMP vid båda tidpunkterna (fig. 4B). Denna höga mitokondriella membranpotential korrelerar med mångdubbelt hög formazanbildning i varje mitokondrion i bestrålade celler (infälld bild i fig. 2Aiii), vilket tyder på hyperkomplex II (SDH)-aktivitet (fig. 2Aii till Gii), förmodligen på grund av strålningsinducerad ökad ΔΨm. Denna observation är i linje med tidigare resultat i andra studier, som tyder på att komplex II är effektivare när det gäller att etablera och upprätthålla ΔΨm under stressförhållanden32,33. Det ökade ΔΨm på grund av hyperaktivt komplex II säkerställer ökad aktivitet av andra mitokondriella dehydrogenaser också, vilket kan bidra till ökad formazanbildning förutom SDH.

Succinatdriven oxidation via komplex-II (SDH) har konstaterats ha ett betydande bidrag till den ökade mitokondriella ROS-bildningen34. Därför analyserade vi mitokondriernas superoxidnivå i kontrollceller och bestrålade celler för att testa det faktum att hypermetaboliskt aktiva mitokondrier borde producera mer superoxidradikal. Celler som färgats med MitoSox (mitokondriell ROS-indikator) analyserades på flödescytometer. Bestrålade celler uppvisar signifikant ökad MitoSox-fluorescens jämfört med respektive kontroll. Båda cellinjerna visade en nästan 1,25-faldig ökning av mitokondriell ROS vid 24 timmar, men den ökade ytterligare till 1,65 gånger i HeLa och 1,5 gånger i MDA-MB-231-celler vid 48 timmar efter strålningsexponering (fig. 4C). Eftersom det mitokondriella dehydrogenaset SDH är den viktigaste bidragsgivaren till MTT-reduktionen7,8,9,10, bekräftar dessa resultat observationen att ökad ROS är direkt proportionell mot den ökade SDH-aktiviteten34. Dessa resultat tyder på att den ökade mitokondriella massan består av funktionellt hyperaktiva mitokondrier som reducerar en större mängd MTT i formazan per cell i bestrålade prover.

Bestrålning inducerar kalciumackumulering i mitokondrier

Ioniserande strålning stör den cellulära kalciumhomeostasen vilket leder till ett ökat frisättande av kalcium från endoplasmatiskt retikulum (ER) till cytoplasma, vilket sedan buffras av funktionella mitokondrier i cellernas perinukleära region35,36. Förändrad kalciumhomeostas inducerar också ROS-produktion (reaktiva syrearter) och mitokondriell biogenes35,36,37.

För att undersöka om den ökade metaboliska livsdugligheten som observerades vid 24 och 48 timmar beror på ökade cytoplasmatiska och mitokondriella Ca2+-nivåer uppskattades fri cellulär och mitokondriell Ca2+. Kontroll- och behandlade celler färgades med Fluo-3AM (Ca2+-indikator) och Rhod-2AM (specifik mitokondriell Ca2+-indikator)38 vid respektive tidpunkt och analyserades på flödescytometer. Den signifikanta ökningen av kalciumnivån observerades i bestrålade celler, som ökade med nästan 1,4 gånger (40 %) i båda de undersökta cellinjerna (HeLa och MDA-MB-231), vilket antyds av ökad Fluo-3-fluorescens vid 8 timmar, som minskar marginellt vid 24 timmar (fig. 5A). Intressant nog noterades en ännu mer strålningsinducerad ökning av mitokondriellt Ca2+ (2,4 gånger i HeLa och 1,6 gånger i MDA-MB-231, fig. 5B). Denna observation verifierades ytterligare genom att visualisera de färgade cellerna i fluorescensmikroskop. Celler som färgats med Mitotracker Red, Fluo-3AM och Rhod-2AM oberoende av varandra 24 timmar efter strålbehandlingen observerades. Fluo-3AM och Rhod-2AM visar båda en stark perinukleär punktformig fluorescens med samma mönster som Mitotracker Red i strålningsexponerade motsvarande celler (fig. 5C), vilket tyder på att ökat cytoplasmatiskt Ca2+ ackumuleras i mitokondrier. Specifika Ca2+-signaler från mitokondrier i Rhod-2AM-färgade celler bekräftar dessutom denna observation. Intressant nog visade MDA-MB-231-cellerna redan höga mitokondriella Ca2+-värden (Rhod-2-AM-färgning) och perinukleära mitokondriella kluster (Mitotracker Red-färgning) i kontrollcellerna, vilket ökar ytterligare efter bestrålning, vilket skulle kunna vara orsaken till att denna cell visade den lägsta ökningen av den strålningsinducerade mitokondriella biogenesen och formazanbildningen i efterhand. Vi har i vår tidigare studie visat att strålning orsakar ackumulering av Ca2+ i mitokondrier vilket leder till mitokondriell skada och mitofagi36. Mitokondrier med högt Ca2+ och ökad mitokondriell membranpotential ackumulerar mer A23187 och visar ljusare fluorescens i mikroskop vid UV-excitation. Permanent skadade mitokondrier visar dock mycket hög fluorescens och framträder som runda kroppar inuti cellen36. För att observera Ca2+-ackumulering i mitokondrier under dessa experimentella förhållanden färgade vi kontroll- och bestrålade HeLa- och MDA-MB-231-celler 24 timmar efter exponering (fig. 5C). Bestrålade celler uppvisade också högre ackumulering av kroppar vilket indikerar strålningsinducerade skadade mitokondrier. Bestrålade celler uppvisar högre Mitotracker Red-, Fluo-3AM- och Rhod-2AM-fluorescens i den perinukleära regionen (fig. 5C), där mitokondrierna bildar ett nätverk med endoplasmatiska retikulum (ER) och ackumulerar det mesta av det stressinducerade Ca2+-läckaget från ER och skyddar cellerna från att dö39. Detta resultat tyder på att Ca2+ som frigörs från lagren efter strålningsexponering huvudsakligen ackumuleras i mitokondrier. Det har tidigare rapporterats att högt Ca2+ i mitokondriernas matris ökar SDH-aktiviteten40. Därför korrelerar vi att Ca2+ som ackumuleras i mitokondrier ökar SDH-komplexaktiviteten vilket leder till hyperaktiva mitokondrier och ökad metabolisk livsduglighet i strålningsexponerade celler.

Kalciumackumulering i mitokondrier leder till cellulärt hyperaktivt metaboliskt tillstånd

För att styrka Ca2+:s roll i den ökade formazanbildningen testade vi vidare om Ca2+-störningar i cellerna ensamma kan öka den metaboliska livskraften. För att testa detta påstående behandlades cellerna med Ca2+ jonoforen A23187 (2 µM, som ökar det cytoplasmatiska Ca2+, samma som joniserande strålning) i 1 timme och analyserade den metaboliska livskraften vid 4, 8 och 24 timmar efter behandlingen. Intressant nog visade celler som behandlats med A23187 signifikant ökad (1,6 gånger) metabolisk viabilitet per cell vid 8 & 24 timmar i HeLa och 4 & 8 timmar i MDA-MB-231 (fig. 6A), efter behandling. Dessa resultat tyder på att ökat cytoplasmatiskt Ca2+ ökar den metaboliska livskraften, genom att öka ackumuleringen av Ca2+ i mitokondrier (fig. 5C). Vi kontrollerade också om inhibering av Ca2+-ackumulering i mitokondrier kan hindra den strålningsinducerade ökningen av mitokondriernas massa. Intressant nog fann vi att celler som behandlades med en hämmare av mitokondriell Ca2+ uniporter, Ruthenium Red (RuR, som hämmar ackumuleringen av Ca2+ i mitokondrier), uppvisade en signifikant låg ökning av mitokondrieinnehållet (strålningsinducerad) jämfört med enbart strålning (fig. 6B). Det är känt att ökat Ca2+ inducerar mitokondriell biogenes genom CaMKII (Calmodulin Kinase-II)37,41, som också är ett mitokondriellt resident protein som är känt för att reglera PGC-1α-uttrycket37,41,42. Därför drar vi slutsatsen att inhibering av Ca2+-ackumulering i mitokondrier med hjälp av rutheniumrött minskade mitokondriernas massa, troligen genom att hämma den mitokondriella biogenesen. För att validera om strålningsinducerad ökad cytoplasmatisk Ca2+ och dess ackumulering i mitokondrierna leder till ökad metabolisk livsduglighet i bestrålade celler, behandlade vi cellerna med BAPTA-AM (en intracellulär kalciumkälla) och RuR, 30 minuter före bestrålning. Chelatering av ökat cytoplasmatiskt Ca2+ med BAPTA-AM (fig. 6C) och inhibering av ackumulationen av Ca2+ i mitokondrier med RuR (fig. 6D) upphävde båda den strålningsinducerade ökade metaboliska livsdugligheten efter 24 och 48 timmars bestrålning i HeLa- och MDA-MB-231-celler (fig. 6C och D). Dessa resultat tyder på att strålningsinducerad störning i Ca2+ homeostas också spelar en viktig roll för hyperaktivering av mitokondrier och ökad metabolisk livskraft, troligen uppströms till mitokondriell biogenes.