Van ’t Hoff fick sitt tidigaste rykte inom organisk kemi. År 1874 förklarade han fenomenet optisk aktivitet genom att anta att de kemiska bindningarna mellan kolatomer och deras grannar var riktade mot hörnen av en regelbunden tetraeder. Denna tredimensionella struktur förklarade de isomerer som finns i naturen. Han delar äran för detta med den franske kemisten Joseph Le Bel, som oberoende av varandra kom på samma idé.
Tre månader innan han fick sin doktorsexamen publicerade Van ’t Hoff denna teori, som i dag betraktas som grunden för stereokemin, först i en nederländsk pamflett hösten 1874 och sedan i maj följande år i en liten fransk bok med titeln La chimie dans l’espace. En tysk översättning utkom 1877, vid en tidpunkt då det enda jobb Van ’t Hoff kunde hitta var på veterinärskolan i Utrecht. Under dessa tidiga år ignorerades hans teori i stort sett av forskarsamhället och kritiserades skarpt av en framstående kemist, Hermann Kolbe. Kolbe skrev:
”En dr J. H. van ’t Hoff vid veterinärskolan i Utrecht har tydligen ingen förkärlek för exakta kemiska undersökningar. Han har ansett det vara lämpligare att bestiga Pegasus (tydligen lånad från veterinärskolan) och i sin ’La chimie dans l’espace’ förkunna hur han i sin djärva flygning till toppen av det kemiska Parnassus tyckte att atomerna var ordnade i den kosmiska rymden.”
Omkring 1880 gav dock stöd för Van ’t Hoffs teori från så viktiga kemister som Johannes Wislicenus och Viktor Meyer ett erkännande.
År 1884 publicerade Van ’t Hoff sin forskning om kemisk kinetik med titeln Études de Dynamique chimique (”Studier i kemisk dynamik”), där han beskrev en ny metod för att bestämma reaktionsordningen med hjälp av grafik och tillämpade termodynamikens lagar på kemiska jämvikter. Han introducerade också det moderna begreppet kemisk affinitet. År 1886 visade han en likhet mellan beteendet hos utspädda lösningar och gaser. År 1887 grundade han tillsammans med den tyske kemisten Wilhelm Ostwald en inflytelserik vetenskaplig tidskrift med namnet Zeitschrift für physikalische Chemie (”Tidskrift för fysikalisk kemi”). Han arbetade med Svante Arrhenius teori om elektrolyters dissociation och 1889 gav han ett fysikaliskt rättfärdigande av Arrhenius ekvation. År 1896 blev han professor vid den preussiska vetenskapsakademin i Berlin. Hans studier av saltfyndigheterna i Stassfurt var ett viktigt bidrag till Preussens kemiska industri.
Van ’t Hoff blev docent i kemi och fysik vid Veterinärhögskolan i Utrecht. Därefter arbetade han som professor i kemi, mineralogi och geologi vid Amsterdams universitet i nästan 18 år innan han slutligen blev ordförande för kemiavdelningen. År 1896 flyttade Van ’t Hoff till Tyskland, där han avslutade sin karriär vid universitetet i Berlin 1911. År 1901 fick han det första Nobelpriset i kemi för sitt arbete med lösningar. Hans arbete visade att mycket utspädda lösningar följer matematiska lagar som är mycket lika de lagar som beskriver gasers beteende.