En av de egenskaper hos enzymer som gör dem så viktiga som diagnostiska verktyg och forskningsverktyg är den specificitet de uppvisar i förhållande till de reaktioner de katalyserar. Några få enzymer uppvisar absolut specificitet; det vill säga de katalyserar endast en viss reaktion. Andra enzymer är specifika för en viss typ av kemisk bindning eller funktionell grupp. I allmänhet finns det fyra olika typer av specificitet:
- Absolut specificitet – enzymet kommer att katalysera endast en reaktion.
- Gruppspecificitet – enzymet kommer endast att verka på molekyler som har specifika funktionella grupper, till exempel amino-, fosfat- och metylgrupper.
- Länkningsspecificitet – enzymet kommer att verka på en viss typ av kemisk bindning oavsett resten av molekylstrukturen.
- Sterokemisk specificitet – enzymet kommer att verka på en viss sterisk eller optisk isomer.
Trots att enzymer uppvisar stora grader av specificitet kan kofaktorer tjäna många apoenzymer. Till exempel är nikotinamid adenin dinukleotid (NAD) ett koenzym för ett stort antal dehydrogenasreaktioner där det fungerar som väteacceptor. Bland dessa finns alkoholdehydrogenas, malatdehydrogenas och laktatdehydrogenas.