Immunohistokemi (IHC) är en kraftfull mikroskopibaserad teknik för att visualisera cellkomponenter, t.ex. proteiner eller andra makromolekyler i vävnadsprover. Styrkan med IHC är det intuitiva visuella resultatet som avslöjar förekomsten och lokaliseringen av målproteinet i samband med olika celltyper, biologiska tillstånd och/eller subcellulär lokalisering i komplexa vävnader.
IHC-tekniken uppfanns under 1940-talet (Coons, Creech, & Jones, 1941) och används rutinmässigt som ett viktigt redskap inom hälsovården och patologin, t.ex. i diagnostiska syften eller för att stratifiera patienter för optimerade behandlingsregimer. IHC används också i stor utsträckning inom forskningen där molekyler av intresse analyseras för att studera deras roll i både friska och sjuka celler och vävnader på molekylär, cellulär eller vävnadsnivå. Det finns många olika sätt att utföra visualisering av mål i vävnader med hjälp av IHC eller IHC-baserade metoder, och det finns många protokoll för olika tillämpningar och analyser. Även om IHC i allmänhet är en robust och etablerad metod behöver nya assays ofta en noggrann optimering beroende på vävnaden eller egenskaperna hos målproteinet, bindemedelsmolekylen och/eller reportersystemet. Många års teknisk utveckling och den enormt ökade tillgången på specifika bindningsmolekyler har avsevärt förbättrat IHC:s användbarhet och användningsområden. Framstegen på området för IHC-baserade tekniker och reagenser har gjort det möjligt för forskare och vårdgivare att få tillgång till mer exakta verktyg, analyser och biomarkörer. Dessutom har de tekniska framstegen möjliggjort t.ex. högkänslig samtidig detektion av flera proteiner i samma prov och detektion av protein-proteininteraktioner (se Proximity Ligation Assay).
Den klassiska IHC-analysen illustreras i figur 1 och innebär att man upptäcker epitoper som uttrycks av ett enskilt målprotein i ett vävnadsprov med hjälp av en ”primär antikropp” som kan binda dessa epitoper med hög specificitet. Efter bindningen mellan epitop och antikropp tillsätts en ”sekundär antikropp” som kan binda den primära antikroppen med hög specificitet. Den sekundära antikroppen är kopplad till en rapportmolekyl och efter bindningen mellan antikropp och antikropp tillsätts ett kemiskt substrat som reagerar med rapportmolekylen för att producera en färgad utfällning på den plats där hela epitop-antikroppskomplexet finns.
Figur 1. Grundprincipen för immunohistokemi.
I den schematiska illustrationen (figur 1) färgas ett formalinfixerat paraffininbäddat vävnadsavsnitt med hjälp av en primär antikropp riktad mot ett specifikt proteinmål. En lösning som innehåller den primära antikroppen tillsätts till vävnadsavsnittet och antikropparna får en viss tid på sig att hitta och binda till sitt mål. Efter detta steg tvättas obundna och överflödiga antikroppar bort och den sekundära antikroppen tillsätts. Den sekundära antikroppen, som har en länkmolekyl med pepparrotsperoxidasenzymer (HRP), får också en viss tid på sig att binda till den primära antikroppen, följt av ytterligare ett tvättsteg. Därefter tillsätts 3,3′ diaminobenzidin (DAB). HRP-enzymet omvandlar DAB-substratet till en brunaktig utfällning som deponeras i vävnaden på den plats där reaktionen ägde rum, vilket ger en visuell representation av var den primära antikroppen först band sitt mål.
Teknik
Vävnadsberedning
Vävnaden spelar en central roll i försöket och det är viktigt att den bearbetas så att epitoper och korrekt morfologi bevaras. Den vanligaste bearbetningen för IHC är att förbereda formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) vävnadsblock. Syftet med formalinfixering är att åstadkomma kemisk tvärbindning av proteiner i vävnaden. Detta avslutar alla cellprocesser och fryser cellkomponenterna på den plats och i den konformation de befann sig i vid fixeringstillfället och förhindrar även nedbrytning. Efter lämplig fixering bearbetas vävnaden ytterligare och bäddas slutligen in i paraffinblock, som sedan skärs ut i tunna skivor (vanligtvis 4-10 µm) med hjälp av en mikrotom. Sektionerna överförs till glasobjektsglas och får fästa innan vidare bearbetning.
Andra metoder för fixering än formalin används ibland. Dessa inkluderar andra typer av aldehyder eller användning av olika alkohollösningar. Det bästa valet av fixeringsmedel är mycket beroende av analysen. Ett vanligt alternativ till FFPE är att förbereda frysta vävnadsprover. I detta fall bäddas vävnaden in i ett kryoskyddande medium och fryses ner, och fixeringen utförs efter snittet. Frysta vävnader sektioneras i kryostater och har fördelen av korta bearbetningstider och bättre bevarande av känsliga epitoper, men kan ofta vara sämre än FFPE-vävnader när det gäller att bevara den histologiska morfologin.
Antigen (epitope) retrieval
Ett problem som förknippas med tvärbindande fixeringsmedel som formalin, eller för lång tid i fixeringsmediet, är att epitoper maskeras, vilket kan hindra den primära antikroppen från att binda till sitt mål. Särskilt när det gäller FFPE-prover finns det ofta ett behov av att återgå till en del av den kemiska tvärbindningen och ”hämta” epitoperna innan man går vidare till själva IHC-undersökningen. Det finns flera protokoll för att hämta antigener och de viktigaste strategierna omfattar behandling av vävnadsliden med värme, matsmältningsenzymer, rengöringsmedel eller kombinationer av dessa. Den vanligaste metoden för antigenåterhämtning i FFPE-prover är att tryckkoka vävnadsglasen i en sur citratbuffert i cirka 15-20 minuter.
Antikroppsbindning
Bindningsmolekylens kvalitet och specificitet är avgörande för alla IHC-baserade tekniker, och valet av bindemedel kan direkt påverka resultatet, tillförlitligheten och möjligen även tolkningen av analysen. Antikroppar är den överlägset vanligaste typen av bindningsmolekyl som används för IHC, och även om de flesta antikroppar kan detektera rätt molekyl av intresse på ett adekvat sätt, kan de också variera kraftigt i sin specificitet för sitt avsedda mål. Antikroppar med hög specificitet är därför mer tillförlitliga vid tolkning av ”on-target”-bindning, eftersom de producerar liten eller ingen ”off-target”-bindning eller ”bakgrund”. Antikroppar som är mindre specifika kan producera mer off-target-bindning, och den resulterande bakgrunden kan eventuellt störa den korrekta tolkningen av de verkliga on-target-signalerna. Det finns två huvudtyper av antikroppar: polyklonala antikroppar som är en heterogen blandning av antikroppar som binder olika epitoper på målet och monoklonala antikroppar som alla binder samma epitop. Polyklonala antikroppar är ofta mycket potenta på grund av sin förmåga att upptäcka och binda flera epitoper på samma mål. De epitoper som de binder är dock ofta dåligt definierade, och med flera och varierande epitopspecificiteter följer en ökad sannolikhet för bindningshändelser utanför målet och bakgrundsbrus. Styrkan hos polyklonala antikroppar kan dock vara fördelaktig eftersom koncentrationen av bindningshändelser kring målmolekylen vanligtvis uppväger potentiellt bakgrundsbrus. En nackdel är att polyklonala antikroppar vanligtvis är begränsade resurser eftersom de kommer från djursera. Monoklonala antikroppar har däremot större kontinuitet eftersom de kan framställas i hybridomcellinjer. Monoklonala antikroppar är också ofta väldefinierade när det gäller epitopbindning, men kan ändå ge resultat som är svåra att tolka om specificiteten är låg eller om målepitopen finns i liten mängd.
Det krävs noggrann optimering och titrering av antikroppskoncentrationen för varje analys, eftersom resultatet inte bara beror på antikroppens specificitet och affinitet för målmolekylen, utan också på koncentrationen och tillgängligheten av on-target- och potentiella off-target-epitoper som finns i provet. Om för många antikroppar tillsätts i provet ökar antalet möjliga bindningshändelser med låg affinitet utanför målet när epitopen eller epitoperna på målet är mättade med bindare. Genom att sänka antikroppskoncentrationen blir off-target-bindningshändelser mer sällsynta eftersom de vanligtvis har lägre affinitet än on-target-bindningshändelser. Risken när man försöker minska bakgrunden genom att använda en antikropp med låg affinitet är att signalerna på måltavlan samtidigt försvagas till den grad att de ger ett falskt negativt resultat.
Andra typer av bindemedelsmolekyler som ibland används i IHC-baserade tekniker inkluderar affibodies, peptider, antikroppsfragment eller andra små molekyler.
Detekteringssystem
Helheten med att utföra IHC är att erhålla en visuell representation av var målet kan hittas i den experimentella vävnaden, och företrädesvis också att erhålla information om målets uttrycksmönster bland heterogena cellpopulationer och/eller subcellulära lokaliseringar. Detta exemplifieras i figur 2, som visar hur olika antikroppar används för att visualisera olika cell- eller vävnadsavdelningar i en komplex vävnad. För att visualisera interaktionen mellan mål och antikropp behövs någon form av detektionssystem som producerar en observerbar färgning eller signal. Den vanligaste metoden för att införa ett detektionssystem i experimentet är att använda en sekundär antikropp som bär på en förbundet reportermolekyl, dvs. ett enzym eller en fluorofor. Sekundära antikroppar är vanligtvis specifikt riktade mot antikroppsmolekyler från en annan djurart. Om t.ex. den primära antikroppen är odlad på en kanin måste den sekundära antikroppen vara odlad på ett annat djur och riktad specifikt mot antikroppar från en kanin.
| Esofagus | Förstoring | |||
|---|---|---|---|---|
| Hematoxylinfärgning | Ingen antikroppsfärgning | |||
| TP63 CAB000083 |
Kärnfärgning | |||
| EGFR CAB000035 |
Membranös färgning | |||
| G6PD HPA000247 |
Cytoplasmafärgning | |||
| LAMB2 (Laminin) CAB000053 |
Konnektivvävnad |
Figur 2. Visualisering av olika proteinmål i komplexa vävnader. Den högra kolumnen visar en förstoring av motsvarande bilder i den vänstra kolumnen.
I I IHC-bilden (figur 2), på varandra följande sektioner av mänsklig matstrupe som färgats med fyra olika antikroppar, gör det möjligt att direkt jämföra olika proteinuttrycksmönster i vävnaden och i subcellulära kompartment. De övre bilderna är endast motfärgade med hematoxylin för jämförelse. Antikroppen p63 färgar cellkärnor i en population av celler som befinner sig i den basala delen av esofagusepitelet. Antikroppen EGFR (Epidermal growth factor receptor) verkar färga samma cellpopulation som p63, men färgar cellmembran i stället för cellkärnor. G6PD-antikroppen (Glukos-6-fosfatdehydrogenas) färgar cytoplasman i en bredare repertoar av esofageala epitelceller och även celler som finns i bindväven. Laminin (LAMB2)-antikroppen färgar endast celler och strukturer i den bindväv som ligger till grund för matstrupen.
För FFPE-vävnadsprover är den vanligaste detektionsmetoden att använda enzymatiska reaktioner för att generera en färgad utfällning på den plats där antikroppen binds. De sekundära antikropparna bär sedan på ett enzym, t.ex. pepparrotsperoxidas (HRP) eller alkaliskt fosfatas (AP), som kan omvandla kromogener som 3,3′ diaminobenzidin (DAB) eller 5-bromo-4-klor-3-indolylfosfat/ p-nitroblåttetrazoliumklorid (BCIP/NBT) till bruna eller blåaktiga utfällningar som deponeras i vävnaden på den plats där reaktionen sker. Kromogena färgningar kan observeras i ljusmikroskopi och är vanligtvis mycket stabila under långa tidsperioder, vilket är fördelaktigt om experimentet måste arkiveras eller granskas vid en senare tidpunkt.
För frysta vävnadssektioner är det vanligare att använda sekundära antikroppar som är bundna till en fluorofor och som avger en specifik färg (vanligen grönt, rött eller blått) när de exciteras av rätt våglängder av ljus. Dessutom är fluorophorer vanligtvis inte stabila under långa perioder. Fördelen med att använda fluorophorer är dock att de ger en enkel metod för att utföra dubbelmärkningsexperiment där flera antikroppar mot flera mål analyseras i samma prov. De sekundära antikropparna måste vara riktade mot olika primära antikroppar och även kopplas till olika fluorophorer. De olika sekundära antikropparna observeras sedan separat genom att de exciteras sekventiellt med olika våglängder av ljus. Dessa olika exciteringsresultat sparas som separata bilder (eller färgkanaler) och kan senare överlagras för att härleda till samlokalisering av proteiner etc.
Användning av reporterbärande sekundära antikroppar för detektion är i sig ett förstärkningssteg eftersom flera sekundära antikroppar kan binda en enda primär antikropp, men ibland önskas ytterligare förstärkningssteg för att öka experimentets signal och känslighet. I sådana fall kan den sekundära antikroppen i stället bära ”länkmolekyler”, t.ex. biotinpolymerer, som kan rekrytera ett större antal reportermolekyler i efterföljande steg. Denna strategi för att förstärka signaler är användbar för både enzymatiska och fluorescerande detektionsmetoder.
Konterfärgning
Immunohistokemisk färgning med hjälp av kromogener gynnas ofta av att en motfärgning appliceras som förstärker kontrasten och underlättar observationen av histologiska särdrag. Den vanligaste typen av motfärgning som används för FFPE-prover är hematoxylin som färgar cellulär cytoplasma med en blek blåaktig färg och färgar cellkärnor i en mörkare blåaktig nyans. Fluorescerande färgningar motfärgas vanligen inte med hematoxylin, eftersom detektionsmetoden inte är baserad på ljusmikroskopi. I stället är det vanligaste sättet att få en motfärgning för fluorescens att märka cellkärnor genom att tillsätta fluorescerande färgämnen som binder nukleinsyror. Efter den egentliga immunohistokemiska reaktionen är de enda återstående stegen att täcka och försegla provet för skydd och långtidsförvaring. Det vanligaste sättet är att ”limma” täckglaset på provet med hjälp av kommersiellt tillgängliga specialtillverkade hartser.
Specifika exempel
IHC används i stor utsträckning inom både forskning och klinisk praxis. Projektet Human Protein Atlas (HPA) är ett utmärkt exempel på hur IHC med hög kapacitet används för att i stor skala kartlägga det mänskliga proteomet i en mängd olika vävnader, cancerformer och celler. I HPA-projektet underlättar en strömlinjeformad intern produktionskedja för antikroppar i stor skala genereringen av specifika antikroppar, som efter att ha genomgått grundläggande karakteriserings- och valideringsförfaranden används för att systematiskt färga vävnadsmikroarrayer som innehåller hundratals vävnadskärnor inom ett enda experiment. Det system för IHC som används av HPA bygger i hög grad på standardisering av protokoll och automatisering med hjälp av maskiner, men utvärderingen av den optimala titreringen för varje antikropp görs manuellt innan antikroppen godkänns för färgning av den fullständiga uppsättningen vävnader. Varje färgad vävnadskärna kommenteras med avseende på immunohistokemisk färgning i vävnader och celltyper och publiceras därefter som en högupplöst bild på webbportalen så att alla fritt kan se den.
I klinisk praxis används IHC främst inom patologin för att hjälpa läkare att utvärdera vävnadsprover med avseende på friska och/eller sjuka tillstånd, för att ställa diagnoser och för att definiera den molekylära subtypen av olika typer av cancer. Ett specifikt exempel där IHC används diagnostiskt är när patologer får ett prov från en metastaserande tumör och det primära tumörens vävnadsursprung är okänt. I dessa fall använder patologerna en panel av olika antikroppar som är riktade mot vävnadsspecifika proteiner, t.ex. prostataspecifikt antigen för prostatacancer, eller östrogenreceptor för gynekologisk cancer, eller cytokeratin 20 för gastrointestinal cancer (Gremel et al., 2014). När en bred klassificering har gjorts används ytterligare vävnadsspecifika antikroppar för att ytterligare fastställa ursprunget för primärtumören. Denna information är användbar för att välja den bästa eller lämpligaste strategin för läkemedelsbehandling och/eller för att lokalisera primärtumören för strålbehandling och/eller kirurgi.
Referenser och länkar
Gemensamt använda antikroppar för cancerdiagnostik:
Gremel G et al., A systematic analysis of commonly used antibodies in cancer diagnostics. Histopathology. (2014)
PubMed: 24330150 DOI: 10.1111/his.12255
En genomgång av validering av antikroppar för IHC:
O’Hurley G et al., Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Mol Oncol. (2014)
PubMed: 24725481 DOI: 10.1016/j.molonc.2014.03.008
Antibodypedia – En databas med öppen tillgång till offentligt tillgängliga antikroppar och deras användbarhet i olika tillämpningar:
IHC world – Protocols, Forum, Products, m.m.a.o.m.
Ett YouTube-klipp som illustrerar IHC från BioGenexLaboratories: