Immunoassay Screening av difenhydramin (Benadryl®) i urin och blod Using a Newly Developed Assay

De sömnframkallande effekterna av DPH har resulterat i att det har kombinerats med andra läkemedel som t.ex. paracetamol, i formuleringar som Tylenol PM™, eller med nasala avsvällande medel som pseudoefedrin. Även om DPH är ett av de äldsta antihistaminerna finns det lätt tillgängligt över disk och är effektivare och snabbverkande än några av de senaste receptbelagda läkemedlen, därav dess utbredda användning (6). Varningsetiketten på Benadryl anger tydligt faran med att köra bil efter att ha tagit medicinen. Vidare har ett flertal studier tydligt visat att motoriska färdigheter och kognitiva prestationer i samband med den komplexa uppgiften att köra bil har försämrats efter intag av DPH jämfört med andra generationens antihistaminer eller till och med alkohol (7-12). Det har också gjorts en studie om den ökade risken för skador efter att ha tagit DPH jämfört med andra generationens antihistaminer (13). Dessa studier skulle tydligt rationalisera vikten av att i första hand testa sig för DPH.

DPH finns i flera doseringsformer, bland annat i flytande form, tabletter, kapslar, tuggumminor och topiska krämer. Den föreslagna dosen för vuxna ligger i intervallet 25-50 mg var 4-6 timme, utan att överstiga 50-100 mg (1). När DPH tas absorberas det snabbt av kroppen, med maximal aktivitet som ses ungefär 1 timme efter att läkemedlet tagits. Halveringstiden för DPH är cirka 2-9 timmar, med högsta plasmakoncentrationer som uppnås efter cirka 1-4 timmar efter intag av dosen. Efter en oral engångsdos på 50 mg upptäcktes genomsnittliga topplasmakoncentrationer på 83 ng/ml difenhydramin efter 3 h, som sedan minskade till 9 ng/ml efter 24 h (14). En oral engångsdos på 100 mg DPH resulterade i genomsnittliga topp-plasmakoncentrationer på 112 ng/mL 2 timmar efter dosen (15). Effekten av antihistaminer ses vid koncentrationer över 25 ng/ml, sömnighet kan observeras vid 30-40 ng/ml och psykisk nedsättning observeras vid koncentrationer över 60 ng/ml (16). Det har rapporterats att de terapeutiska nivåerna av DPH i blodet ligger mellan 25 och 112 ng/mL, de toxiska nivåerna ligger på cirka 5 000 ng/mL och de dödliga nivåerna ligger någonstans över 8 000 ng/mL (3, 17). Det har också funnits flera fall av DPH-missbruk som dokumenterats under många år (18-20).

In vivo metabolism av DPH resulterar i att cirka 30 % av dosen omvandlas till N-desmetylmetaboliten, följt av bildning av N,N-didesmetylmetaboliten och 13 % av dosen omvandlas till acetylmetaboliter via aminen. En liten procentandel omvandlas till difenylmetoxiättiksyra och den återstående stora procentandelen av dosen utsöndras oförändrad som moderläkemedel (21, 22). Metabolismen av difenhydramin beskrivs i figur 2.

Traditionella metoder för att testa DPH i human plasma har inneburit dyr och tidskrävande provextraktion följt av bekräftelseförfaranden. Flera grupper har rapporterat om användning av olika gaskromatografiska (GC) metoder för detektion av DPH i plasma och urin (23-27). Det har också rapporterats om kapillärelektrofores (28) och metoder för vätskekromatografi och masspektrometri (LC-MS) (29) som har utvecklats för detektion av DPH. Hittills har det inte funnits några rapporter i litteraturen om screening för difenhydramin med hjälp av ELISA eller någon annan immunoassaymetod. I denna publikation rapporterar vi om den första ELISA-screeningmetoden för DPH i human urin och blod.

Det anses vara standardpraxis i toxikologiska laboratorier att utföra en immunoassay-screening, där positiva prover först identifieras och ytterligare bekräftas med GC-MS- eller LC-MS-teknik. Detta används av de flesta toxikologiska laboratorier som en ”kostnads-nyttostrategi” i stället för att utföra ett dyrare bekräftande förfarande för varje prov som tas emot. Det skulle därför vara värdefullt med en tillförlitlig ELISA-screeningmetod som kan tillämpas på prover från DPH i samband med trafikolyckor och dödsfall. För att uppnå detta mål har toxikologer lagt fram rekommendationer för DUID, inklusive ett föreslaget gränsvärde för DPH på 25 ng/ml i blod och 50 ng/ml i urin (30). I denna artikel beskrivs en robust och noggrann ELISA-screeningmetod för DPH i human urin och blod som följer dessa föreslagna riktlinjer.

Experimentellt

Material

Reagens och kemikalier. Difenhydramin erhölls från Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI) och difenhydramin-d3 (100 μg/mL lösning i metanol) erhölls från Cerilliant (Round Rock, TX). DPH-specifika polyklonala antikroppar framställdes av Immunalysis (Pomona, CA), och DPH-haptener och pepparrotsperoxidas-märkta konjugat syntetiserades av Immunalysis. Substratreagenset 3,3′,5,5′-tetrametylbenzidin (TMB) som användes för den kolorimetriska reaktionen erhölls från Pierce (Rockford, IL). De enzymer som användes i processen var bovint thyroglobulin (BTG) från Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), pepparrotsperoxidas (HRP) från BBI Enzymes (Madison, WI) och bovint serumalbumin (BSA) från Proliant Biologicals (Boone, IA). Alla lösningsmedel som användes var av HPLC-kvalitet och alla kemikalier var av ACS-kvalitet och kom från Spectrum Chemicals (Gardena, CA). För ELISA framställdes de höga kalibratorerna för DPH på 1000 ng/ml i syntetisk negativ urin och syntetiskt negativt blod och förvarades vid 4°C. Syntetisk negativ urin och syntetiskt negativt blod som används i denna analys har formulerats med ingredienser som finns i dessa respektive matriser och matchade immunoassaysvaren från tre negativa urin- och blodprover från människor (31, 32). Syntetisk negativ urin består av en 0,1 % BSA-lösning i avjoniserat vatten med 0,2 % FD&C-gult #6-färgämne, och syntetiskt negativt blod består av en egen Immunalysis-formulering.

Apparat. HiTrap protein G HP affinitetskolonner som användes för rening av immunoglobulin G (IgG) köptes från GE Healthcare (Pittsburgh, PA). Standardpolystyrenmikrotiterplattor (96 brunnar) erhölls från Corning Costar (Corning, NY). En Tecan Columbus Pro-mikrotiterplattediskmaskin och en Tecan Sunrise-plattläsare erhölls båda från Tecan (San Jose, CA). Pipetter som användes under utvecklingsprocessen för immunoassayet kom alla från Rainin Instruments (Oakland, CA). En 6410 triple-quadrupole MS och Zorbax Eclipse XDB C18-kolonnen som användes för LC-MS-MS-analysen köptes båda från Agilent Technologies (Santa Clara, CA).

Metoder

ELISA. Det första steget i utvecklingen av ELISA-metoden innebar generering av polyklonala antikroppar som baserades på det immunokemiska svaret hos en utvald djurart på ett DPH-specifikt antigen. För att uppnå detta mål immuniserades först kaniner med ett DPH-antigen som består av DPH konjugerat till bovint thyroglobulin (BTG). Immuniseringen och avblodningen av kaninerna lades ut på entreprenad till en specialiserad djuranläggning. Serumet från kaninerna renades internt genom affinitetskromatografi genom eluering genom protein G-kolonner för att erhålla den renade IgG-fraktionen. Det DPH-specifika polyklonala IgG:et immobiliserades sedan på 96-håls polystyrenmikrotiterplattor. Överskottet av antikroppar sögs upp, de fria antikroppsbindningsställena blockerades med en 1 % trehaloslösning i vatten och plattorna torkades sedan i en vakuumugn vid 37 °C över natten. Plattorna förvarades vidare i en förseglad påse med torkmedel, eftersom det är viktigt att hålla dem fuktfria. En dosresponskurva för DPH-urin framställdes först genom att berika negativ syntetisk urin med 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250 och 500 ng/ml från den höga kalibrerande stamlösningen av läkemedlet. Blodkurvan framställdes genom att berika negativt syntetiskt blod med 1, 5, 10, 25, 50, 100 och 250 ng/ml från den höga kalibreringslösningen. Dessa kalibratorer i syntetiskt blod späddes sedan ytterligare 1:10 med 100 mM fosfatbuffert innehållande 150 mM natriumklorid (fosfatbuffrad saltlösning, pH 7,0) före analys. Alla blodprover späddes på samma sätt 1:10 med fosfatbuffrad saltlösning (pH 7,0). Urinprover späddes också 1:20 med 100 mM fosfatbuffrad saltlösning (pH 7,0). Kalibratorer och prover pipetterades sedan i två exemplar i mikrotiterplattans brunnar, med en provstorlek på 10 μl för både urin och blod. Därefter tillsattes 100 μl enzymkonjugat bestående av difenhydramin märkt med HRP. Plattan fick sedan inkuberas i 1 timme i mörker i rumstemperatur. Brunnarna tvättades sedan sex gånger med 350 μl avjoniserat vatten med hjälp av en mikrotiterplattvasker, sögs av för att avlägsna vatten, vändes sedan om och slogs torrt för att avlägsna eventuellt kvarvarande vatten från brunnarna. Det kromogena TMB-substratet (100 μL) tillsattes sedan i varje brunn och plattan inkuberades i ytterligare 30 minuter i mörker. Reaktionen stoppades sedan med 100 μL 1 N saltsyra för att ge en gul färg. Testet är kolorimetriskt och absorbansen avlästes vid en dubbel våglängd på 450 nm och 650 nm med hjälp av en mikrotiterplattläsare. Våglängden 650 nm mäter bakgrundsabsorbansen, som plattläsaren sedan subtraherar från den slutliga absorbansen. Intensiteten av den färg som produceras är omvänt proportionell mot koncentrationen av analyten i provet.

LC-MS-MS. För analysen användes en LC-pump i 1200-serien kopplad till en 6410 trippelkvadrupol-MS som arbetar i positivt elektrosprayjoniseringsläge (ESI). Den LC-MS-MS-kolonn som användes var en Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 × 50 mm × 1,8 µm). Provet för analys förbereddes på följande sätt: ett 100 µl urinprov som innehöll 50 µl difenhydramin-d3 (200 ng/mL) tillsattes till en autosamplerflaska. Proverna injicerades direkt i LC-MS-MS via en autoinjektor. Kolonntemperaturen hölls på 60 °C och injektionsvolymen var 5 µl. Den rörliga fasen bestod av 0,2 % ättiksyra pH 4 (lösningsmedel A) och metanol (lösningsmedel B). Inledningsvis var den rörliga fasens sammansättning 100 % A med en flödeshastighet på 0,7 ml/min under en period på 6 min, därefter ökades procentandelen metanol till 100 %, för att sedan återgå till 100 % A efter 7 min.

Gastemperaturen var 350 °C, gasflödet var 10 l/min och nebulisatortrycket hölls på 50 psi. Kväve användes som kollisionsgas och kapillärspänningen var 4000 V. Två övergångar valdes ut och optimerades för varje läkemedel. Dwelltiden var 50 ms och den optimala fragmenteringsenergin var 80 V för alla övergångar. De optimala kollisionsenergispänningarna fastställdes till 35 V för den deutererade interna standarden (difenhydramin-d3), 15 V för den primära övergången och 30 V för den sekundära övergången för difenhydramin självt. Förhållandet mellan den kvalificerande övergången och den kvantifierande övergången bestämdes ungefär i mitten av kalibreringsområdet: 100 ng/ml. Övergången för difenhydramin-d3 var 259,7 > 165,2; primär (kvantifierande) övergång för difenhydramin var 256,7 > 167,2; kvalificerande (sekundär) övergång 256,7 > 152,2. Omärkt difenhydramin kan delas upp i produktjoner med m/z 167 eller 165 från prekursorjonen beroende på den applicerade kollisionsenergin. Vårt förfarande validerades med hjälp av de beskrivna förhållandena. Detektionsgränsen (LOD) för LC-MS-MS-metoden var 10 ng/mL och fastställdes som den lägsta koncentration som kan detekteras med ett signal/brusförhållande > 2.

Resultat och diskussion

Dosresponskurva

Metoden utnyttjar kompetitiv bindning mellan enzymkonjugatet och den fria analyten i provet för en fast mängd antikroppsbindningsställen, proportionell mot deras koncentration i blandningen. Dosresponskurvorna för DPH framställdes i syntetisk negativ urin och syntetiskt negativt blod vid de koncentrationer som beskrivits tidigare. B0 är absorbansen för den negativa kalibratorn och B representerar absorbansen för de enskilda kalibratornivåerna. Det procentuella förhållandet mellan individuell kalibrator och negativ kalibrator (B/B0) beräknades för varje kalibratornivå och plottades mot läkemedelskoncentrationen (ng/mL) för både urin och blod (figur 3). B/B0-värdena är omvänt proportionella mot koncentrationen av läkemedel i provet, eftersom ju högre läkemedelskoncentrationen är, desto mindre binder läkemedels-enzymkonjugatet till antikroppen, vilket ger ett lägre absorbansvärde.