Gertrude Stein föddes i Allegheny i Pennsylvania den 3 februari 1874 som dotter till rika tysk-judiska invandrare. Vid tre års ålder flyttade hennes familj först till Wien och sedan till Paris. De återvände till Amerika 1878 och bosatte sig i Oakland, Kalifornien. Hennes mor, Amelia, dog i cancer 1888 och hennes far, Daniel, dog 1891.
Stein gick på Radcliffe College 1893-1897, där hon specialiserade sig på psykologi under den kända psykologen William James. Efter att ha lämnat Radcliffe skrev hon in sig vid Johns Hopkins University, där hon studerade medicin i fyra år och slutade 1901. Stein fick ingen formell examen från någon av institutionerna.
1903 flyttade Stein till Paris med Alice B. Toklas, en yngre väninna från San Francisco som skulle förbli hennes partner och sekreterare under hela hennes liv. Paret återvände inte till USA på över trettio år. Under första världskriget var de frivilliga tillsammans och körde förnödenheter till sjukhusen i Frankrike.
Samman med Toklas och hennes bror Leo, en konstkritiker och målare, tog Stein en lägenhet på Vänsterbanken. Deras hem, 27 rue de Fleurus, blev snart en samlingsplats för många unga konstnärer och författare, däribland Henri Matisse, Ezra Pound, Pablo Picasso, Max Jacob och Guillaume Apollinaire.
Hon var en passionerad förespråkare för det ”nya” i konsten, och hennes litterära vänskap växte till att omfatta så olika författare som William Carlos Williams, Djuana Barnes, F. Scott Fitzgerald, James Joyce och Ernest Hemingway. Det var till Hemingway som Stein myntade uttrycket ”den förlorade generationen” för att beskriva de utflyttade författare som bodde utomlands mellan krigen.
Häromkring 1913 orsakade Steins stöd till kubistiska målare och hennes alltmer avantgardistiska skrivande en brytning med hennes bror Leo, som flyttade till Florens. Hennes första bok, Three Lives, publicerades 1909. Hon följde den med Tender Buttons (Claire Marie) 1914, Tender Buttons visade tydligt vilken djupgående effekt det moderna måleriet hade på hennes författarskap. I dessa små prosadikter möts bilder och fraser på ofta överraskande sätt – på ett sätt som liknar det kubistiska måleriet. Hennes skrivande, som kännetecknas av att hon använder ord för deras associationer och ljud snarare än för deras innebörd, väckte stort intresse från andra konstnärer och författare, men fann inte någon bred publik.
Av Steins mest inflytelserika verk kan nämnas The Making of Americans (1925); How to Write (1931); The Autobiography of Alice B. Toklas (1933), som blev en bästsäljare; och Stanzas in Meditation and Other Poems (1956). Sherwood Anderson skrev i inledningen till Geography and Plays (1922) att hennes författarskap ”består av en återuppbyggnad och en helt ny omformning av livet i ordets stad.”
Stein dog på det amerikanska sjukhuset i Neuilly den 27 juli 1946 av en inoperabel cancer.