00:00:07.25Hej, mitt namn är Jennifer Doudna från UC Berkeley
00:00:09.26och jag är här i dag för att berätta om hur vi upptäckte
00:00:12.26en ny teknik för genomteknik.
00:00:15.07Denna historia börjar med ett bakteriellt immunsystem
00:00:20.12som innebär att vi måste förstå hur bakterier
00:00:22.14bekämpar en virusinfektion.
00:00:24.26Det visar sig att en hel del bakterier
00:00:28.04har i sin kromosom,
00:00:30.09vilket är vad du tittar på här
00:00:32.15en sekvens av upprepningar som visas i dessa svarta diamanter
00:00:36.18som är interfolierade med sekvenser
00:00:40.19that kommer från virus
00:00:43.08och dessa har uppmärksammats av mikrobiologer
00:00:46.20som sekvenserade bakteriegenom men ingen visste
00:00:50.10vilken funktion dessa sekvenser kunde ha
00:00:53.06 tills man märkte att de tenderar att också förekomma
00:00:58.09med en rad gener som ofta kodar för proteiner
00:01:03.29som har homologi med enzymer som gör intressanta saker
00:01:09.03som DNA-reparation.
00:01:10.12Så det var en hypotes att detta system
00:01:14.04som kom att kallas CRISPR
00:01:16.08som är en akronym för denna typ av repetitiva locus
00:01:19.14att dessa CRISPR-system faktiskt kunde vara
00:01:22.29ett förvärvat immunsystem i bakterier
00:01:26.00som skulle kunna tillåta att sekvenser integreras
00:01:29.06från virus och sedan på något sätt användas senare
00:01:32.07för att skydda cellen från en infektion
00:01:35.26med samma virus.
00:01:37.05Så detta var en intressant hypotes
00:01:39.11och vi började studera detta
00:01:41.18i mitten av 2000-talet direkt efter publiceringen
00:01:44.15av tre artiklar som påpekade
00:01:47.13att virala sekvenser
00:01:50.00integrerades i dessa genomiska loci.
00:01:52.07Och vad som framkom under de följande åren
00:01:55.17var att dessa CRISPR-system
00:01:58.08 verkligen är förvärvade immunsystem i bakterier
00:02:01.18 så fram till dess visste ingen att bakterier
00:02:04.24 faktiskt kunde ha ett sätt att anpassa sig
00:02:08.08till virus som kommer in i cellen
00:02:10.29 men det här är ett sätt som de gör det på
00:02:12.14 och det innebär att man upptäcker främmande DNA
00:02:15.17som injiceras som i det här exemplet
00:02:18.04från ett virus som tar sig in i cellen
00:02:20.07, CRISPR-systemet möjliggör integrering
00:02:26.06av korta bitar av dessa virus-DNA-molekyler
00:02:29.15i CRISPR-lokuset
00:02:31.07och sedan i det andra steget
00:02:33.27som här visas som CRISPR RNA-biogenes
00:02:38.20 dessa CRISPR-sekvenser transkriberas faktiskt
00:02:42.20i cellen till bitar av RNA
00:02:45.15som sedan används tillsammans
00:02:48.23med proteiner som kodas av CAS-generna
00:02:52.09 dessa CRISPR-associerade gener
00:02:54.01för att bilda interferens- eller interferenskomplex
00:02:58.12som kan använda informationen i form
00:03:01.17av dessa RNA-molekyler för att basparera
00:03:04.08med matchande sekvenser i viralt DNA.
00:03:07.18Så ett mycket smart sätt som bakterier
00:03:10.12har kommit på för att ta sina inkräktare
00:03:13.06och vända sekvensinformationen mot dem.
00:03:17.00Så i mitt eget laboratorium
00:03:20.21har vi länge varit mycket intresserade av att förstå hur RNA-molekyler
00:03:23.09används för att hjälpa celler att ta reda på
00:03:32.00hur de ska reglera uttrycket av proteiner
00:03:34.00.03från genomet.
00:03:35.05Och så detta verkade också vara ett mycket intressant
00:03:37.27exempel på detta och
00:03:39.18vi började studera de grundläggande molekylära mekanismerna
00:03:42.24med vilka denna väg fungerar.
00:03:45.01 Och 2011 åkte jag till en vetenskaplig konferens
00:03:49.23och träffade en kollega till mig,
00:03:52.13Emmanuelle Charpentier som visas på den här bilden
00:03:56.10 längst till vänster och Emmanuelle’s labb
00:03:58.14arbetar med mikrobiologiska problem och de är
00:04:02.11särskilt intresserade av bakterier
00:04:04.00som är patogener för människor.
00:04:06.01Hon studerade en organism som heter
00:04:08.03Streptococcus pyogenes som är en bakterie
00:04:11.15som kan orsaka mycket allvarliga infektioner hos människor
00:04:14.25och vad som var märkligt med denna insekt var att den
00:04:16.25har ett CRISPR-system och i den organismen
00:04:19.06det fanns en enda gen som kodade för ett protein
00:04:21.27 som kallas Cas9
00:04:23.12och som genetiskt hade visat sig vara nödvändig
00:04:26.09för att CRISPR-systemet skulle fungera
00:04:28.16i Streptococcus pyogenes,
00:04:30.23 men ingen visste då vilken funktion
00:04:33.05det proteinet hade.
00:04:34.20Och så vi gick samman och rekryterade
00:04:37.20människor från våra respektive forskningslaboratorier
00:04:40.26för att börja testa Cas9:s funktion.
00:04:43.17De viktigaste personerna i projektet
00:04:45.20 visas här på fotografiet
00:04:48.00i mitten står Martin Jinek
00:04:50.03som är postdoktoral medarbetare i mitt eget labb
00:04:52.17och bredvid honom i blå skjorta
00:04:54.22är Kryztof Chylinski som var student
00:04:57.20i Emmanuelles labb
00:04:58.26och så dessa två killar tillsammans med
00:05:00.21Ines Fonfara som är längst till höger,
00:05:02.10 som är postdoktor med Emmanuelle
00:05:04.01 började göra experiment över Atlanten
00:05:07.25och dela med sig av sina data.
00:05:10.09Och vad de kom fram till var att
00:05:13.06Cas9 faktiskt är ett fascinerande protein
00:05:16.04som har förmågan att interagera med DNA
00:05:19.28och generera en dubbelsträngad brytning
00:05:22.02i DNA vid sekvenser som matchar
00:05:25.06sekvensen i ett guide RNA
00:05:27.08och det du ser på denna bild
00:05:29.06är att guide-RNA
00:05:30.10och sekvensen av guiden i orange
00:05:32.11i baspar med en sträng
00:05:34.18av det dubbelspiralformade DNA
00:05:37.11i baspar med en sträng
00:05:34.18av det dubbelspiralformade DNA
00:05:37.11och mycket viktigt är att detta RNA
00:05:39.28 interagerar med en andra RNA-molekyl
00:05:42.09 som kallas tracr och som bildar en struktur
00:05:46.03 som rekryterar Cas9-proteinet
00:05:47.29 så att dessa två RNA:er och ett enda protein
00:05:50.13 i naturen är vad som krävs
00:05:52.23för att detta protein ska känna igen
00:05:56.05vad som normalt skulle vara virus-DNA
00:05:58.11i cellen och proteinet
00:06:01.13kan dela upp dessa,
00:06:02.14 bokstavligen genom att bryta upp det dubbelspiralformade DNA:t.
00:06:05.24Och när vi kom på detta
00:06:08.14 tänkte vi: skulle det inte vara fantastiskt
00:06:10.26 om vi faktiskt kunde generera ett enklare system
00:06:13.29som naturen har gjort
00:06:15.02 genom att koppla ihop dessa två RNA-molekyler
00:06:18.04för att generera ett system som skulle bestå av ett enda protein
00:06:20.16och ett enda vägledande RNA.
00:06:22.28Så idén var att i princip ta
00:06:25.17 dessa två RNA som du ser på den bortre sidan
00:06:29.29av bilden och sedan i princip koppla ihop dem
00:06:33.19för att skapa vad vi kallar
00:06:35.04ett enda vägledande RNA.
00:06:36.Så Martin Jinek i labbet
00:06:38.25 gjorde den konstruktionen
00:06:40.21och vi gjorde ett mycket enkelt experiment
00:06:44.22för att testa om vi verkligen hade
00:06:46.18ett programmerbart DNA-klyvningsenzym
00:06:49.29och idén var att generera korta enskilda guide-RNA
00:06:54.04som känner igen olika platser i en cirkulär DNA-molekyl
00:06:59.24som ni ser här
00:07:00.21och guide-RNA:n utformades
00:07:03.10för att känna igen de sekvenser som visas av de röda staplarna
00:07:06.17på bilden och experimentet var sedan
00:07:10.16att ta denna plasmid, denna cirkulära DNA-molekyl
00:07:13.21och inkubera den med två olika restriktionsenzymer (eller skärande enzymer),
00:07:18.27En som kallas SalI som skär
00:07:21.23DNA:n typ uppströms i den bortre änden
00:07:25.05av DNA:n i den här bilden
00:07:26.12i den grå rutan,
00:07:27.19och den andra platsen som är riktad
00:07:31.00av den RNA-styrda Cas9
00:07:33.13på dessa olika platser som visas i rött.
00:07:35.16Och ett mycket enkelt experiment
00:07:37.19vi gjorde denna inkubationsreaktion
00:07:39.26med plasmid-DNA och detta är resultatet
00:07:43.24och detta är vad du tittar på
00:07:45.28är en agarosgel
00:07:47.29som gör det möjligt för oss att separera
00:07:49.16de klyvda DNA-molekylerna
00:07:51.20och vad du kan se är att i var och en av dessa reaktionsbanor
00:07:54.22får vi en DNA-molekyl av olika storlek som frigörs
00:07:58.12från denna dubbelt smälta plasmid
00:08:00.16 där DNA:s storlek
00:08:03.29 motsvarar klyvning vid de olika platserna
00:08:06.11 som styrs av dessa guide RNA-sekvenser
00:08:08.26 som är markerade i rött
00:08:10.24 så detta var ett riktigt spännande ögonblick
00:08:12.29 egentligen ett mycket enkelt experiment som var
00:08:15.15 som ett slags ”A ha!”-ögonblick
00:08:17.03 då vi sa att vi verkligen har ett programmerbart DNA-skärande enzym
00:08:22.02 och att vi kan programmera det med en kort bit RNA
00:08:24.15 för att klyva i princip vilken dubbelsträngad DNA-sekvens som helst
00:08:28.15.07Så anledningen till att vi blev så glada
00:08:30.23över ett enzym som kan programmeras
00:08:33.19för att generera dubbelsträngade DNA-klyvningar
00:08:36.01i vilken sekvens som helst är för att
00:08:39.Det fanns en lång rad experiment
00:08:42.16 i forskarsamhället som visade
00:08:45.13att celler har sätt att reparera dubbelsträngade DNA-brott
00:08:49.26som leder till förändringar
00:08:52.02i den genomiska informationen i DNA
00:08:55.21Det här är en bild som visar att
00:08:58.20när ett dubbelsträngat brott genereras
00:09:01.14av något slags enzym som kan göra detta
00:09:04.13 inklusive Cas9-systemet
00:09:06.05Dessa dubbelsträngade brott i en cell
00:09:09.07upptäckts och repareras av två typer av vägar
00:09:13.15En till vänster som involverar
00:09:17.26non-homologous end joining
00:09:20.07 där DNA-ändarna kemiskt ligeras
00:09:24.07 tillbaka till varandra vanligtvis med introduktion
00:09:26.18 av en liten insättning eller deletion
00:09:28.25 på platsen för brottet
00:09:29.27och på höger sida
00:09:32.01är ett annat sätt som reparation sker
00:09:34.00genom homologiriktad reparation
00:09:37.22där en donator-DNA-molekyl
00:09:39.14som har sekvenser som matchar de
00:09:43.28 som flankerar platsen för det dubbelsträngade brottet kan integreras
00:09:48.05 i genomet på platsen
00:09:50.10 för brottet för att införa ny genetisk information
00:09:54.06 i genomet
00:09:55.Detta hade alltså gett många forskare
00:09:59.04 idén att om det fanns ett verktyg
00:10:01.04eller en teknik som gjorde det möjligt för
00:10:03.05forskare att införa
00:10:06.12dubbelsträngade brytningar vid målinriktade ställen
00:10:09.00i en cells DNA så tillsammans
00:10:12.12med alla data om genomsekvensering
00:10:14.21som nu finns tillgängliga vet vi
00:10:16.10en cellens hela genetiska sekvens
00:10:18.21och om man visste var en mutation har uppstått
00:10:21.20som orsakar en sjukdom till exempel
00:10:23.20kan man faktiskt använda en teknik som denna
00:10:26.25för att introducera DNA som skulle åtgärda en mutation
00:10:31.00eller generera en mutation
00:10:32.23som man skulle vilja studera i en forskningsmiljö
00:10:35.04Så kraften i den här tekniken är
00:10:38.28 egentligen idén att vi nu kan generera
00:10:41.20 sådana här typer av dubbelsträngade brytningar
00:10:43.17på platser som vi väljer som forskare
00:10:46.17 genom att programmera Cas9 och sedan låta
00:10:48.13cellen göra reparationer som introducerar
00:10:51.04genomiska förändringar på platserna för dessa brytningar
00:10:54.15 men utmaningen var hur man genererade brytningarna
00:10:58.11 i första hand och därför hade ett antal
00:11:00.09 olika strategier tagits fram
00:11:03.24 för att göra detta i olika laboratorier
00:11:05.15De flesta av dem, och jag ska visa
00:11:08.21 två specifika exempel här
00:11:10.17en som kallas zinkfingernukleaser
00:11:12.25och den andra TAL-effektordomäner
00:11:15.02de är båda programmerbara sätt
00:11:18.08för att generera dubbelsträngade brott i DNA
00:11:20.21som bygger på proteinbaserad igenkänning
00:11:23.29av DNA-sekvenser så detta är proteiner
00:11:26.06som är modulära och kan genereras
00:11:29.12i olika kombinationer av moduler
00:11:31.22för att känna igen olika DNA-sekvenser
00:11:34.03Det fungerar som teknik
00:11:37.18men det krävs en hel del proteinteknik
00:11:40.24för att göra det, och det som är riktigt spännande
00:11:43.16om detta CRISPR/Cas9-enzym
00:11:46.11är att det är ett RNA-programmerat protein
00:11:49.25så ett enda protein kan användas för
00:11:52.09någon plats på DNA där vi
00:11:54.27vill skapa en brytning
00:11:56.13 genom att helt enkelt ändra sekvensen
00:11:58.16 av det guide-RNA som är associerat med Cas9
00:12:00.24 så i stället för att förlita oss på proteinbaserad igenkänning
00:12:03.06 av DNA förlitar vi oss på
00:12:06.04RNA-baserad igenkänning av DNA
00:12:08.26som visas i botten så vad detta betyder
00:12:11.03är att det är bara ett system
00:12:12.18som är tillräckligt enkelt att använda
00:12:15.15för vem som helst med grundläggande molekylärbiologisk utbildning
00:12:19.05kan dra nytta av detta system
00:12:20.29för att göra genomteknik
00:12:22.20och detta är alltså ett verktyg som verkligen
00:12:26.06jag tror fyller ut en viktig
00:12:29.03och tidigare saknad komponent
00:12:30.24 av vad vi skulle kunna kalla biologins IT-verktygslåda
00:12:33.29 som inte bara omfattar förmågan
00:12:36.00att sekvensera DNA och titta
00:12:38.06på dess struktur, vi vet om
00:12:39.24dubbelhelixen sedan 1950-talet
00:12:42.00och sedan under de senaste decennierna
00:12:44.18har det varit möjligt att använda enzymer
00:12:46.09som restriktionsenzymer
00:12:47.26och polymeraskedjereaktionen
00:12:49.09för att isolera och amplifiera särskilda segment
00:12:52.19av DNA och nu med Cas9
00:12:55.10har vi en teknik som möjliggör
00:12:57.15en smidig genomkonstruktion
00:12:59.13och som är tillgänglig för laboratorier runt om i världen
00:13:03.07för experiment som de kanske vill göra
00:13:05.08och detta är alltså en sammanfattning av tekniken
00:13:10.11av tvåkomponentsystemet
00:13:11.29som bygger på RNA-DNA-basparning
00:13:14.16för igenkänning
00:13:15.21och mycket viktigt på grund av det sätt
00:13:18.24som detta system fungerar är det
00:13:19.28 faktiskt ganska enkelt
00:13:21.18att göra något som kallas multiplexering
00:13:24.20vilket innebär att vi kan programmera Cas9
00:13:27.00med flera olika guide-RNAs
00:13:28.23i samma cell för att generera
00:13:30.19 flera brott och göra saker
00:13:32.06som att skära ut stora segment av en kromosom
00:13:35.01och helt enkelt radera dem i ett enda experiment.
00:13:38.25Och så detta har lett till en verklig explosion
00:13:42.03 inom biologi och genetik
00:13:45.19 med många laboratorier runt om i världen
00:13:48.08 som använder denna teknik
00:13:49.25 för alla sorters mycket intressanta
00:13:51.15och kreativa tillämpningar
00:13:53.13och det här är en bild
00:13:54.24som faktiskt är nästan föråldrad nu
00:13:56.11men bara för att ge dig en känsla
00:13:57.14av hur fältet
00:14:00.07har tagit fart
00:14:01.08och så publicerade vi vårt ursprungliga arbete om Cas9
00:14:04.10i 2012 och fram till dess
00:14:07.16 pågick mycket lite forskning
00:14:08.18 om CRISPR-biologi någonstans
00:14:11.12Det var ett mycket litet område
00:14:12.19och du kan se att
00:14:13.27från 2013 och framåt
00:14:16.09tills nu har det skett en otrolig explosion av publikationer
00:14:17.21 från laboratorier som använder
00:14:22.09 detta som en teknik för genomteknik
00:14:24.Det har därför varit mycket spännande för mig som grundforskare att se vad som började som ett grundforskningsprojekt som förvandlades till en teknik som visar sig vara mycket användbar för alla möjliga sorters forskning.28 spännande experiment
00:14:37.07och jag ville bara avsluta med att dela
00:14:40.07 med er några saker
00:14:42.17som pågår med hjälp av den här tekniken
00:14:44.17så naturligtvis på vänster sida
00:14:47.13Mängder av grundläggande biologi som kan göras nu
00:14:50.02med hjälp av modellorganismer
00:14:53.03och olika typer av cellinjer
00:14:55.02som odlas i laboratoriet
00:14:56.21för att studera cellernas beteende
00:14:58.13men även inom biotekniken för att kunna
00:15:01.23göra riktade förändringar i växter
00:15:05.15och olika typer av svampar som kan vara mycket
00:15:07.11nyttiga för olika typer av industriella tillämpningar
00:15:09.29och sedan naturligtvis inom biomedicin
00:15:12.14med stort intresse för potentialen
00:15:14.14att använda denna teknik som ett verktyg
00:15:17.03för att verkligen komma fram till nya terapier
00:15:21.06för mänskliga sjukdomar tror jag att det är något
00:15:23.09som är mycket spännande och verkligen är något
00:15:26.05som redan finns på horisonten
00:15:27.09och den här bilden visar verkligen
00:15:30.20 vart jag tror att det här kommer att ta vägen
00:15:33.15 i framtiden med många intressanta
00:15:36.20och kreativa inriktningar
00:15:39.03som kommer att utvecklas i olika laboratorier
00:15:41.02både i akademiska forskningslaboratorier
00:15:43.19men också i allt större utsträckning i kommersiella laboratorier
00:15:45.29som kommer att göra det möjligt att använda den här tekniken för alla möjliga tillämpningar
00:15:49.24
00:15:52.18 varav många vi inte ens kunde ha
00:15:54.10 föreställt oss för två år sedan.
00:15:56.05Så mycket spännande och jag vill bara berömma ett fantastiskt team
00:16:01.10av människor som har varit involverade i arbetet
00:16:04.22med projektet tillsammans med mig och vi har
00:16:06.07hittat fantastiskt ekonomiskt stöd från olika grupper
00:16:11.00och det har varit ett nöje
00:16:13.00att dela detta med er, tack.