Metodologiska tillvägagångssätt
Gentiken för CAVD har historiskt sett kopplats till CF sedan 1968 då Kaplan et al. visade att nästan alla män med CF har obstruktiv azoospermi (OA) på grund av CBAVD (Kaplan et al. 1968). Konceptet att isolerade former av CBAVD och cystisk fibros är kopplade till samma gen bekräftades kort efter att CFTR-genen identifierades 1989 (Dumur et al. 1990; Anguiano et al. 1992). Det noterades dock snart att 20-40 % av CBAVD-fallen inte var kopplade till CFTR-mutationer, vilket tyder på möjligheten av genetisk heterogenitet (Culard et al. 1994; Chillón et al. 1995). Trots detta förblev genetiken för CAVD i 25 år begränsad till CFTR. Faktum är att studiet av den genetiska determinismen av mänsklig infertilitet länge har begränsats av specifika metodologiska begränsningar, där de traditionella familjebaserade tillvägagångssätten med hjälp av kopplingsanalys ofta är olämpliga, särskilt när det gäller manlig infertilitet på grund av psykosociala och kulturella hinder. Därför har de genetiska markörer som vanligtvis används i klinisk praxis för att utforska en icke-obstruktiv azoospermi (NOA) fram till nyligen varit begränsade till kromosomala avvikelser som Klinefelters syndrom och mikrodeletioner av Y-kromosomen (Krausz 2011). Under det senaste decenniet har dock tillkomsten av nästa generations sekvensering (NGS) gjort det möjligt att utveckla kraftfulla metoder baserade på hel-exomsekvensering (WES) eller helgenomsekvensering (WGS) och analys av hela transkriptom. Ungefär 20 gener som är involverade i monogena former av NOA har nyligen identifierats (granskad av Ghieh et al. 2019). För nästan alla dessa gener har kausala mutationer, alla recessiva, identifierats i konsanguina familjer (Yang et al. 2018). Å andra sidan har, såvitt vi vet, exceptionella familjefall av OA aldrig observerats i ett sammanhang av konsanguinitet, en begränsning som delvis förklarar varför antalet nya gener som identifierats i CAVD har varit mycket lägre, trots de nya genomiska tillvägagångssättenas lättnader. Under de senaste åren har dock två viktiga kompletterande tillvägagångssätt bidragit till identifieringen av kandidatgener; de som bygger på studier av individuella genomer och de som bygger på transkriptomanalyser av cellerna i sädesledaren, främst i epididymis. Den första ledde till att relevanta korrelationer mellan iCBAVD och punktmutationer i ADGRG2-genen som identifierats genom WES-analys (Patat et al. 2016; Khan et al. 2018), samt variationer i antalet kopior i PANK2- och SLC9A3-generna som identifierats genom array-baserad komparativ genomisk hybridisering (array-CGH-analys) (Lee et al. 2009) fastställdes. Transkriptomiska metoder med hjälp av cDNA-mikroarray eller RNA-sekvensering har lyckats rikta in sig på många funktionella kandidatgener, särskilt gener vars uttryck är begränsat till celler i sädesledaren eller vars uttrycksprofil är specifik för vissa delar av sädesledaren (Browne et al. 2016). Flera av dessa kandidatgener som ADGRG2 och SLC9A3 har validerats i knockoutmöss och deras fysiologi har undersökts i denna djurmodell (Davies et al. 2004; Wang et al. 2017). Nyligen har en integrativ multi-omisk metod som kombinerar WGS, metylomanalys av hela DNA och RNA-sekvensering lett till identifiering av två nya kandidatgener, SCNN1B och CA12, hos en individ med iCBAVD (Shen et al. 2019). Men trots dessa framsteg finns det fortfarande ingen genetisk diagnos för minst en fjärdedel av CAVD:erna, varav de flesta är CUAVD:er. Hittills har hypotesen att dessa oförklarliga former av CAVD inte är resultatet av enkla genetiska variationer utforskats i liten utsträckning. Man kan förutse att de nya metoderna för att studera epigenomet och de kraftfulla bioinformatiska verktygen i framtiden kommer att göra det möjligt att specificera den epigenomiska regleringens roll i förekomsten av dessa isolerade CAVD:er. Detta tillvägagångssätt kommer dock att bli desto mer framgångsrikt om det tillämpas på kohorter av adekvat storlek som består av perfekt fenotypade CAVD-patienter av homogent etniskt ursprung.
Gener som är inblandade i CAVD
Men medan den genetiska determinismen för NOAs kännetecknas av betydande genetisk heterogenitet med mer än 30 identifierade gener (SPGF ) är den för OAs begränsad till ett fåtal gener (Ghieh et al. 2019). Därför är det fastställt att ungefär tre fjärdedelar av de kaukasiska fallen av CAVD är kopplade till anomalier i två gener: CFTR för majoriteten av fallen och ADGRG2 för en minoritet (Patat et al. 2016). Andra gener som SLC9A3 kan vara inblandade i vissa iCBAVD men även epigenetiska eller miljöfaktorer med mycket olika fysiopatologiska roller.
CFTR (MIM#602421) identifierades genom positionell kloning 1989 av Riordan et al. (1989), vilket avslutade flera års tävlingsinriktad forskning för att upptäcka den enda genen som är ansvarig för CF. Ungefär hälften av CF-patienterna av nordeuropeisk härkomst är homozygota för en deletion av tre baspar (NM_000493.3:c.1521_1523del), vilket leder till förlust av fenylalanin 508 (NP_000483.3:p.Phe508del, äldre namn: F508del). I genomsnitt är 1 av 40 individer i den kaukasiska befolkningen heterozygot för p.Phe508del-mutationen, vilket gör den till en av de vanligaste patogena mutationerna hos människor (Kerem et al. 1989). CFTR, som täcker 250 kb på kromosom 7:s långa arm i 7q31.2, innehåller 27 kodande exoner och producerar flera transkript, varav endast ett, ett mRNA på 6,1 kb, kodar för ett funktionellt protein på 1 480 aminosyror som kallas CF transmembrane conductance regulator (CFTR). CFTR är ett glykosylerat transmembranprotein som uttrycks vid det apikala membranet i många epitelceller där det huvudsakligen fungerar som en cAMP-reglerad kloridkanal. Många studier har visat att CFTR är involverad i regleringen av flera jontransportörer, bland annat natriumkanaler (ENacs), klorid-/bikarbonatbytare, protonbytare (Na+/H+) och vattenkanaler (aquaporiner). Därför spelar CFTR-beroende fysiologiska processer en avgörande roll för att upprätthålla homeostasen av joner, pH och vatten i sekretoriska epitelvätskor (Choi et al. 2001). Under 3 decennier har mer än 2000 mutationer rapporterats i CFTR (https://www.genet.sickkids.on.ca/), men mindre än en fjärdedel klassificeras som patogener (https://www.cftr2.org/) baserat på korrelationer med CF eller andra tillstånd som ofta har en mindre allvarlig prognos, Begränsad till ett enskilt organ såsom bronkerna (disseminerad bronkiektasi, MIM#211400), bukspottkörteln (kronisk pankreatit, MIM#167800) eller sädesledarna (medfödd bilateral avsaknad av sädesledare, MIM#277180). Dessa tillstånd som inte uppfyller alla kriterier för cystisk fibros men som är relaterade till CFTR-dysfunktion har grupperats under den generiska termen CFTR-RD (Bombieri et al. 2011). Alla regioner av CFTR kan påverkas av sjukdomsframkallande mutationer, inklusive promotorregioner och djupa introniska regioner (Feng et al. 2019; Bergougnoux et al. 2019). Beroende på deras effekter på CFTR:s biogenes och funktioner klassificeras patogena alleler i två huvudkategorier: CF-orsakande varianter (även kallade ”allvarliga”) som i homozygot tillstånd alltid förknippas med CF och icke-CF-orsakande varianter som aldrig har observerats hos CF-patienter och som därför felaktigt kallas ”milda” alleler. En minoritet av CF-orsakande alleler har observerats i varierande kliniska former av mer eller mindre allvarlig cystisk fibros där bukspottkörtelfunktionen ofta är bevarad. Patogeniteten hos dessa alleler som kallas VCC (för varianter med varierande klinisk konsekvens) kan bero på sällan kända genetiska faktorer som cis-association med komplexa alleler eller okända icke-genetiska faktorer. Till skillnad från CF-orsakande varianter orsakar icke-CF-orsakande varianter en ofullständig CFTR-dysfunktion. Beroende på organet kan en CFTR-RD uppträda om den återstående CFTR-aktiviteten är för låg för att upprätthålla homeostasen. Därför bär personer med CFTR-RD i allmänhet på en icke-CF-orsakande variant som oftast kombineras i trans med en CF-orsakande variant eller, mer sällan, med en annan icke-CF-orsakande variant. Dessa alleler kallas ibland för CFTR-RD-orsakande alleler.
ADGRG2 (MIM#300372) belägen i Xp22.13 består av 29 exoner som producerar cirka tio transkript, varav det längsta har en öppen läsram på 3,1 kb (täcker exoner 3-29) som kodar för den adhesiva G-proteinkopplade receptorn G2 (ADGRG2). Dess cDNA klonades ursprungligen 1997 av Osterhoff et al. (1997) efter differentiell screening av ett bibliotek av mänskliga epididymala cDNA-celler där denna klon, kallad HE6 (för humant epididymis-specifikt protein 6), var mycket väl representerad. HE6-proteinet, som har en sekvens på 1017 aminosyror och sju mycket välbevarade transmembrandomäner, tillhör superfamiljen av G-proteinkopplade receptorer (GPCR), där det ursprungligen kallades GPR64. Strukturen och den autokatalytiska egenskapen hos den extracellulära delen av HE6/GPCR64 ledde till dess slutliga klassificering i G-subfamiljen av adhesions-GPCR (aGPCR) (Hamann et al. 2015). ADGRG2 är ett högt glykosylerat protein som nästan uteslutande och i hög grad uttrycks i den proximala delen av de manliga sädeskanalerna (https://proteinatlas.org), just i epitelet i de efferenta duktlarna och den inledande delen av epididymala kanalen. ADGRG2-immunmärkningen är särskilt stark i stereocilerna i de viktigaste epididymala cellerna och i mikrovilli av de icke cilierade cellerna i de efferenta duktlarna där 90 % av den vätska som utsöndras av testiklarna återabsorberas (Kirchhoff et al. 2008; Patat et al. 2016). ADGRG2:s inblandning i denna process föreslogs ursprungligen av HE6/GPR64-knockout (riktad störning) hos möss, vilket hos hemizygota hanar resulterar i en ansamling av vätska i testiklarna och spermastasering i de efferenta duktlarna vilket leder till en obstruktiv infertilitetsfenotyp (Davies et al. 2004). ADGRG2 är en orphanreceptor med okända naturliga ligander och delvis uppklarade signalvägar. Liksom de flesta aGPCR:er är den mogna ADGRG2 en heterodimer som är resultatet av klyvning vid en mycket välbevarad domän som innehåller GPCR-proteolysplatsen (GPS) i ett extracellulärt N-terminalt fragment (NTF) som är icke-kovalent fäst vid ett stort C-terminalt fragment (CTF) som är förankrat i cellmembranet (Obermann et al. 2003). Hur dessa två underenheter samarbetar under inverkan av endogena agonister för att förmedla signaler och om de har separata specifika funktioner är frågor som förblir obesvarade. Det har dock visats att den extracellulära änden av CTF som uppstår vid klyvning bär på en Stachel-sekvens med agonistiska egenskaper (Demberg et al. 2015). Dessutom visar nya experimentella data som erhållits i in vitro- och in vivo-modeller att ADGRG2, via Gs- och Gq-proteinmedierad signalering, kan modulera c-AMP respektive PKC-aktivitet (Demberg et al. 2017; Balenga et al. 2016; Zhang et al. 2018).
Kausala mutationer vid CAVD, typ och epidemiologi
CFTR-mutationer
Mindre än ett år efter att CFTR-genen identifierades (Riordan et al. 1989) observerade Dumur et al. en onormalt hög frekvens av p.Phe508del-mutationen i en liten serie infertila män med iCBAVD (Dumur et al. 1990). Denna upptäckt, som stödde hypotesen att iCBAVD skulle kunna vara en monosymtomatisk form av cystisk fibros, fick stora medicinska konsekvenser. Därefter skulle alla män med iCBAVD som genomgick medicinskt assisterad reproduktionsteknik (ART) genom kirurgiskt uttag av spermier och intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI) anses ha en högre risk att få ett barn med cystisk fibros (Anguiano et al. 1992). Senare bekräftade Chillon et al. att till skillnad från CF-patienter som endast bär på CF-orsakande mutationer som ansvarar för en fullständig förlust av CFTR-kloridkanalens funktion, bär iCBAVD-patienter på minst en CFTR-kopia med en s.k. ”mild” mutation, eftersom den korrelerar med en minskad eller partiell CFTR-aktivitet på 3-8 % (Chillón et al. 1995). Denna situation illustreras väl av en variant av en polythymidin (Tn)-polymorfism i intron 9 (NM_000493.3:c.1210-12T), den så kallade IVS8-5T-allelen (5T-allelen) vars frekvens är fyra till fem gånger högre hos iCBAVD-patienter (granskad av De Sousa et al. 2018). Denna 5T-allel har en skadlig effekt på splicing som främjar överhoppning av exon 10 vilket leder till en betydande minskning av normalt CFTR mRNA (Chu et al. 1993). Upp till en tredjedel av iCBAVD-personerna av europeisk härkomst är sammansatta heterozygoter som bär på en CF-orsakande mutation, varav den vanligaste är F508del, och 5 T-allelen i trans (Chillón et al. 1995). Eftersom denna genotyp emellertid hade observerats hos fertila fäder som hade ett barn med CF, visade Cuppens et al. att penetransen av denna 5 T-allel med avseende på överhoppningen av exon 10 huvudsakligen var beroende av storleken på en polyTG-polymorf sekvens (NM_000493.3:c.1210-34TG) uppströms polyT-sekvensen (Cuppens et al. 1998). Medan den polyvarianta TG(11)5T (NM_000493.3:c.1210-34TGT) alltså övervägande hittas hos friska personer, är det TG(12)5T-kombinationen som oftast hittas hos iCBAVD-personer, medan den mycket mer sällsynta TG(13)5T-allelen alltid identifieras hos iCBAVD-personer (Groman et al. 2004). Under de senaste 20 åren har många studier gjort det möjligt att karakterisera CFTR-mutationsspektrumet hos CBAVD-personer genom att specificera deras frekvens beroende på etnicitet och geografiskt ursprung (granskad av Yu et al. 2012). Även om samma typer av allvarliga mutationer, inklusive stora CFTR-rearrangemang (Taulan et al. 2007), finns hos både CF-CBAVD- och iCBAVD-personerna, är CFTR-mutationsspektrumet i iCBAVD radikalt annorlunda i och med att det finns många icke-CF-orsakande mutationer, av vilka de flesta kan förknippas med andra CFTR-RD-fenotyper, t.ex. pankreatopatier, disseminerad bronkiektasi och sinonasala sjukdomar (Bombieri et al. 2011). Dessa ”milda” mutationer omfattar främst introniska varianter som påverkar splicing, varav den vanligaste är 5T-allelen, och många missense-mutationer som påverkar kloridkanalens funktion, varav den vanligaste hos kaukasier är p.Arg117His (R117H)-mutationen (Casals et al. 2000; Claustres et al. 2000). De flesta av dessa mutationer som inte orsakar CF upptäcks inte av rutinpaneler som utformats för den klassiska CF-populationen och som huvudsakligen är inriktade på de mest frekventa CF-orsakande mutationerna (många tillgängliga kommersiella kit). Det är därför som det vid molekylär diagnostik av CBAVD och andra CFTR-RD rekommenderas att man som förstahandsval väljer ett CFTR-test som omfattar de två viktigaste ”milda” varianterna, R117H, och 5T-allelen (se nedan kapitlet ”Implikationer för klinisk praxis …”). Om detta inte är entydigt bör en omfattande karakterisering av CFTR utföras, inklusive åtminstone sekvensering av alla exoner och flankerande introniska regioner samt ett sökande efter stora omarrangemang. Molekylärdiagnostiska metoder baserade på sekvensering av nya generationer (NGS) används allt oftare för att upptäcka inte bara punktmutationer utan även stora deletioner eller duplikationer. Dessa nya genavläsningsmetoder som kan tillämpas på en panel gör det möjligt att undvika den mödosamma Sangersekvensering och semikvantitativa PCR-tekniker (MLPA, QMPSF, qPCR etc.) som utförs exon för exon.
Frekvenserna av CFTR-mutationer hos CAVD-patienter skiljer sig åt från studie till studie, vilket troligen beror på rekryteringssvårigheter, kohortstorlek och heterogeniteten i genotypningsmetoderna, där många försökspersoner har fått en partiell analys av CFTR. Det är dock tydligt att frekvensen av vissa alleler är mycket olika hos kaukasiska CAVD-patienter och hos patienter från icke-kaukasiska länder där cystisk fibros är mycket mer sällsynt. Detta är särskilt fallet med F508del-mutationen, som i undantagsfall upptäcks hos kinesiska iCBAVD-patienter, medan upp till en tredjedel av iCBAVD-patienterna i norra Europa är bärare. Å andra sidan är iCBAVD-patienter av asiatiskt ursprung oftare bärare av 5T-allelen än kaukasier (tabell 1), medan frekvensen av denna allel i den allmänna befolkningen varierar lite runt om i världen (5 %). Sammantaget visar metaanalysen av de uppgifter som publicerades av Yu et al (2012) att cirka 80 % av kaukasiska iCBAVD-patienter är bärare av minst en mutation i CFTR. Den mest uttömmande möjliga studien lämnar 6 % av personerna utan någon upptäckt mutation (Ratbi et al. 2007). Med tanke på att en del av dessa patienter kan vara enkla heterozygoter (3 % i den kaukasiska populationen) och andra bär på varianter av okänd betydelse som möjligen är neutrala (inte CF- eller CFTR-RD-orsakande), kan man anta att CFTR skulle vara inblandat i 75-80 % av fallen av iCBAVD. För ungefär en fjärdedel av iCBAVD-patienterna kan CFTR:s ansvar därför inte slutgiltigt bevisas, medan de två muterade allelerna för CF-patienter kan karakteriseras i 99 % av fallen (tabell 1). När det gäller CUAVDs bär 30-50 % av personerna på minst en CFTR-mutation efter omfattande gensökning, vilket innebär att mer än hälften av CUAVDs inte är CFTR-relaterade (Schlegel et al. 1996; Casals et al. 2000; Cai et al. 2019; Mieusset et al. 2020). Förekomsten av en njuravvikelse är mycket betydligt vanligare hos CAVD-patienter hos vilka endast en eller ingen CFTR-avvikelse har påvisats (Augarten et al. 1994; Schwarzer & Schwarz 2012). Därför kan man anta att skillnaden i andelen icke-detekterade CFTR-mutationer mellan CBAVD (20 %) och CUAVD (50 %) åtminstone delvis är relaterad till skillnaden i frekvensen av unilateral renal agenesi som observerats i de två grupperna, 5 % respektive 25 % (Weiske et al. 2000; McCallum et al. 2001; Kolettis och Sandlow 2002; Yang et al. 2015).
ADGRG2-mutationer
I 2016, efter att noggrant ha valt ut, från en stor retrospektiv serie av 379 iCBAVD-män med europeisk härstamning, en kohort med 26 individer som varken hade en CFTR-mutation eller associerad njuravvikelse, har Patat et al. identifierade de tre hemizygot trunkerande mutationer i den X-bundna ADGRG2-genen (MIM#300572.0001_3) hos fyra personer (Patat et al. 2016). Fastställandet av dessa mutationers kausala roll i iCBAVD-fenotypen baserades på en rad argument: (i) hanliga ADGRG2 knockout (KO)-möss utvecklar OA utan någon annan signifikant abnormitet (Davies et al. 2004), (ii) histologisk undersökning av en biopsi av en epididymal biopsi av en av de fyra individerna visade att det saknades uttryck av ADGRG2 i epitelet i efferenta duktlar som var onormalt dilaterade, (iii) en av de trunkerade mutationerna identifierades hos två infertila individer som var relaterade genom en länk från moderns sida (en systerson och en morbror från moderns sida). Sedan dess har tre publikationer (Yang et al. 2017; Yuan et al. 2019; Khan et al. 2018) rapporterat identifieringen av fem nya sällsynta variationer av ADGRG2 hos sex iCBAVD-patienter av asiatiskt ursprung utan patogen CFTR-mutation: två nonsense-mutationer som klassificerats som patogena, inklusive en hos två infertila bröder av pakistanskt ursprung (Khan et al. 2018) och tre missense-mutationer, inklusive en som påverkade GPS-regionen och som klassificerades som patogen (Yang et al. 2017). Dessa sex patienter hade inga njuravvikelser. Nyligen har Pagin et al. också rapporterat sex nya ADGRG2-trunkerande mutationer i en kohort av 53 franska CAVD-patienter som bär på 0 eller endast 1 CFTR-defekt allel. I denna studie lyckades författarna inte få övertygande bevis för att stödja hypotesen om ett digeniskt arv som involverar ADGRG2 och CFTR. De drog slutsatsen att inaktivering av ADGRG2 är ansvarig för ungefär 20 % av CAVD som inte är relaterade till CFTR-dysfunktion. Dessutom fann de inget fall av solitär njure bland de 8 ADGRG2-muterade patienterna i deras kohort (Pagin et al. 2019). Intressant nog identifierades inga ADGRG2- eller CFTR-mutationer av Patat et al. i en kohort av 28 iCBAVD-patienter med URA (personliga uppgifter).
Andra mutationer
Såvitt vi vet är de enda andra mutationer, förutom CFTR och ADGRG2, som har väckt frågan om ett möjligt samband med iCBAVD, CNV:er som involverar PANK2- och SLC9A3-gener. Hittills har dessa CNVs endast beskrivits hos iCBAVD-patienter från Taiwan. Liksom i andra asiatiska populationer observeras CF och CFTR-RD sällan i Taiwan, och bortsett från IVS8-5T-allelen, vars frekvens är betydligt ökad hos infertila taiwanesiska iCBAVD-män, har mycket få patogena CFTR-alleler karakteriserats (Chiang et al. 2009). Genom att undersöka CNV:er med hjälp av array-CGH och kvantitativ realtids-PCR i en liten kohort av taiwanesiska iCBAVD-individer identifierade HS Chiangs team hos en enda individ den homozygota förlusten av genen pantothenatkinas 2 (PANK2) (Lee et al. 2009) och hos 11 av 29 försökspersoner förlusten av en kopia av genen för solute carrier family 9 isoform 3 (SLC9A3) (Wu et al. 2018; granskad av Chiang et al. 2019). PANK2 valdes ut som en potentiell reproduktionsrelaterad gen, eftersom KO-musen hade azoospermi (Kuo et al. 2005). Det var dock en NOA och detta tillstånd observeras inte hos drabbade människor med pantothenatkinasassocierad neurodegeneration (MIM#234200). Hittills har inga andra fall av CBAVD relaterade till en deletion av PANK2 rapporterats. Därför förblir sambandet osäkert och observationen anekdotisk. Å andra sidan är de experimentella data som erhållits av samma grupp om SLC9A3:s inblandning i CBAVD-fenotypen omfattande och mer övertygande. Dessa författare visade nämligen att den vuxna hanmusen SLC9A3-/- utvecklar obstruktiv azoospermi på grund av strukturella och funktionella abnormiteter i de efferenta duktlarna med långvarig progressiv atrofi av sädesledarna och sädesblåsorna (Wu et al. 2019; Chiang et al. 2019). Anmärkningsvärt nog observerade författarna en drastisk minskning av CFTR i epididymis och vas deferens i dessa SLC9A3-KO-möss, vilket tyder på interdependenta roller för de två generna i iCBAVD-determinismen (Wang et al. 2017). Men trots dessa mycket upplysande observationer om SLC9A3:s roll i fysiologin i reproduktionsorganen hos hanmöss är förhållandet mellan förlusten av en kopia av denna gen och iCBAVD hos människor fortfarande dåligt förstått. Med tanke på att de recessiva mutationerna av SLC9A3 orsakar en allvarlig form av medfödd diarré genom natriumsekretion (congenital secretory sodium diarrhea, MIM#616868) och att funktionsförlustmutationer, inklusive en fullständig deletion av SLC9A3, har visat sig överföras av heterozygota fäder (Janecke et al. 2015), kan CBAVD hos de taiwanesiska patienterna inte förklaras enbart av SLC9A3 haploinsufficiens. Dessutom har Wu et al. i sin studie rapporterat att bland de 29 taiwanesiska patienterna med iCBAVD konstaterades 6 (20,7 %) vara homozygota eller sammansatta heterozygota för CFTR TG(12)5T- eller TG(13)5T-alleler, en genotypisk status som i sig skulle kunna vara tillräcklig för att orsaka iCBAVD. Av dessa sex personer hade två endast en kopia av SLC9A3. Från samma kohort var 12 andra iCBAVD-patienter heterozygota för TG(12)5T- eller TG(13)5T-allelen, varav hälften också hade en deletion av SLC9A3 (Wu et al. 2019). Möjligheten av digenism som involverar CFTR-variationer som 5T-allelen är fortfarande mycket spekulativ. Det bör noteras att ingen av dessa 29 taiwanesiska CBAVD-patienter hade ensidig njurfrånvaro.