Fyndet av vattenkanaler (Aquaporiner)

Abstract

Vattenrörelsen in i och ut ur celler är en grundläggande biologisk process som är nödvändig för livet. En sådan vattenrörelse reglerar inte bara aktiviteten hos enskilda celler utan är också ansvarig för att många organsystem fungerar och för att upprätthålla hela kroppens vattenbalans. Man har länge misstänkt att vattenrörelsen genom biologiska cellmembran på något sätt förstärks eller underlättas av porer eller kanaler, men sökandet efter att identifiera dessa kanaler har varit långvarigt och mödosamt. Som så ofta är fallet inom vetenskapen upptäcktes hemligheten med vattenkanalen så småningom av en slump 1992 av Peter Agre och hans kollegor vid Johns Hopkins University i Baltimore, som arbetade med membranproteiner från röda blodkroppar. Denna ”första” vattenkanal kallades ursprungligen CHIP28 och är nu känd som aquaporin 1. Agre fick Nobelpriset i kemi 2003 för denna upptäckt. Det finns för närvarande 13 kända akvaporiner hos däggdjur, fördelade i de flesta vävnader, men många fler har identifierats i lägre organismer och i växtriket. Aquaporinernas inblandning i processer som koncentrationen i urinen och kroppsvätskans homeostas, hjärnans funktion, körtelutsöndring, hudens fuktighet, mäns fertilitet, hörsel, syn och de flesta viktiga kroppsfunktioner man kan tänka sig är nu föremål för en intensiv vetenskaplig granskning. Dessutom har defekter i akvaporinfunktionen satts i samband med olika sjukdomstillstånd och patologiska tillstånd. Denna korta översikt kommer att diskutera deras bakgrund, upptäckt och funktion i utvalda kroppsliga processer, med särskilt fokus på hydrering.

© 2017 The Author(s) Published by S. Karger AG, Basel

Varför är vi intresserade av vattenkanaler?

De celler som utgör våra kroppar består till största delen av vatten. Ungefär 65 procent av en cell består av vatten. När det gäller den totala kroppsmassan är spädbarn de mest ”saftiga”, eftersom de består av 75 % vatten; magra vuxna innehåller 60 % vatten, medan äldre vuxna endast innehåller 50 % vatten. Huvuddelen av kroppens torrvikt som inte består av vatten består av ben. Som jämförelse kan nämnas att den kanske mest vattenrika organismen är sallad (95 % vatten), medan vi människor kan jämföras med en banan (65 % vatten). Under evolutionen har cellerna i alla organismer utvecklats för att fungera optimalt i en sådan vattenhaltig miljö, och betydande variationer i cellernas vatteninnehåll kommer att koncentrera eller späda ut deras molekylära komponenter och förhindra normal funktion. Därför måste cellerna reglera mängden vatten som kommer in och ut genom deras plasmamembran för att reglera den cytosoliska koncentrationen av lösningsmedel, joner, elektrolyter, proteiner och nukleinsyror. Dessutom är vattenmängden i de extracellulära utrymmena i en organism också noggrant reglerad. Hos människor och andra däggdjur omfattar detta bl.a. blodvolymen, interstitialutrymmet utanför blodkärlen, cerebrospinalvätskan, kammarvattnet i ögat och körtelsekret.

Varför behöver vi vattenkanaler?

För att klara av de ständigt föränderliga metabola kraven och de omgivande förhållandena måste cellerna snabbt utbyta vatten mellan cytoplasman (på insidan) och den yttre miljön (på utsidan) för att upprätthålla en konstant volym. Detta är viktigt för många lägre organismer som har utvecklat utarbetade mekanismer för reglering av cellvolymen, och inbegriper vanligtvis inte bara vattentransport utan även jonflöden (mestadels Na+, K+ och Cl-) över membranen för att återhämta sig från överdriven svullnad eller krympning när de utsätts för externa vätskor med olika osmolalitet (t.ex. från salt havsvatten till utspätt regnvatten) . Även om dessa jontransportmekanismer också finns hos däggdjur, uppnås en stor del av den reglerande ”homeostatiska” funktionen hos högre organismer genom att upprätthålla en konstant inre miljö där våra celler befinner sig – den berömda ”milieu intérieur” eller ”det inre havet” som definierades av Claude Bernard . Detta uppnås till stor del genom att njurarna, i samordning med hjärnan, känner av plasmavolymen och plasmakoncentrationen (osmolaliteten) och sedan reagerar genom att öka eller minska den mängd vatten som de släpper ut i urinen. Detta kommer att diskuteras närmare nedan.

Förutom att upprätthålla cellvolymen gör ett snabbt vattenutbyte mellan cellerna det möjligt för vävnader och organ att utsöndra och/eller absorbera vatten som en del av sin fysiologiska funktion. Epitelceller som kantar vissa njurtubuli är särskilt väl anpassade till denna funktion, men celler i andra organsystem kan också reglera den transepiteliala vattenrörelsen för att möjliggöra funktionellt viktiga processer. Till exempel involverar de vätskor som utsöndras av bukspottkörteln, gallgången, tår-, spott- och mjölkkörtlarna samt plexus choroidus och retinala pigmentepitelet alla snabb transepitelial vattenrörelse.

Hur rör sig vatten in i och ut ur celler?

Alla dessa fysiologiska processer involverar vattenrörelse över cellmembranen. Man har länge förstått att när de flesta celler placeras i destillerat vatten sväller de avsevärt och kan till slut spricka. När celler däremot placeras i en saltlösning som är mer koncentrerad än salterna och andra komponenter i deras cytoplasma kommer de att krympa. Denna process beror till stor del på osmotiskt vattenflöde, uppåt eller nedåt i en koncentrationsgradient, i ett försök av systemet att jämna ut den osmotiska koncentrationen på båda sidor av cellens plasmamembran. Men hur exakt rör sig vatten över cellmembranet? Med hjälp av en speciell anordning som kan mäta de röda blodkropparnas svullnad och krympning, en experimentell modell som är lätt att få fram och manipulera, kom forskarna fram till att vatten har två vägar genom membranen. När osmotisk svullnad och krympning övervakades vid olika temperaturer upptäckte Solomon en långsam, temperaturkänslig process som överlagrades av en mycket snabbare temperaturoberoende process (fig. 1). Den långsamma processen återspeglade vattnets diffusionsgenomsläpplighet genom plasmamembranets fettlipiddubbelskikt – diffusion är temperaturkänslig. Men den snabba processen överensstämde med förekomsten av vattenporer i membranet, vilket möjliggjorde en snabbare, osmotiskt driven passage av vatten som inte innebar diffusion (fig. 1). Macey och Farmer med flera visade sedan att föreningen kvicksilverklorid avsevärt kunde hämma den snabba komponenten av denna process, vilket tydde på förekomsten av en proteinpora – eller vattenkanal – i membranet. Kvicksilverklorid binder till sulfhydrylgrupper (cysteinrester) på proteiner och hämmar deras funktion: i det här fallet vattenpermeabilitet. Denna forskning med fokus på röda blodkroppar verifierade alltså tydligt konceptet att vattenporer är ansvariga för den snabba, temperaturokänsliga, osmotiskt drivna passagen av vatten genom biologiska membran. Som vi ska se identifierades dessa porer senare som akvaporiner.

Njuren reglerar vårt vatteninnehåll i kroppen

Njuren är ett anmärkningsvärt organ som är mest känt för att ”filtrera” blodet för att avlägsna avfallsprodukter som urea och andra gifter och för att producera urin. Ungefär 180 l blod filtreras varje dag, men de flesta individer producerar endast cirka 1,5 l urin. Den exakta mängden beror på hur mycket du dricker, hur varmt det är och hur mycket du tränar (vilket orsakar vattenförlust genom svettning). Ungefär 90 % av den filtrerade vätskan avlägsnas i de proximala regionerna av njurarna och detta värde är ganska konstant hos de flesta människor. De återstående 10 % (18 L) återabsorberas dock i njurens samlingsrör under påverkan av det antidiuretiska hormonet vasopressin (VP). VP frisätts av den bakre hypofysen som svar på uttorkning (vilket leder till en ökning av den osmotiska koncentrationen i serum) eller volymförlust. Det verkar på epitelcellerna i njurarnas samlingsgångar via en specifik receptor som kallas vasopressinreceptorn (V2R) för att stimulera vattenreabsorption, vilket korrigerar problemet och återställer blodkoncentrationen och/eller blodvolymen till normala nivåer. Den mekanism genom vilken VP orsakar detta vätskeupptag genom samlingsgångsepitelet är nu ganska väl förstådd och involverar vattenkanaler av typen aquaporin.

The Toad Urinary Bladder as a Model for the Kidney

Det är värt att ta ett steg tillbaka och titta på hur VP:s verkningsmekanism undersöktes experimentellt. Även om VP:s effekter på njurfunktionen var välkända sedan en tid tillbaka, krävdes det för en detaljerad dissektion av dess cellulära verkan ett modellsystem som var mer lättillgängligt än njuren. Det är mycket svårt (men inte omöjligt) att arbeta med enskilda njurtubuli, eftersom de är så små – endast cirka 40 µm i diameter. Ett stort genombrott i forskningen kom när Bentley (och andra) upptäckte att paddans urinblåsa också transporterar vatten som svar på antidiuretiskt hormon . Detta är en naturlig del av deras överlevnadsprocess i naturen. När paddan är nedsänkt i vatten absorberar den vatten genom huden och producerar mängder av mycket utspädd urin som den lagrar i en stor, ballongliknande urinblåsa. När paddan har begränsad tillgång till dammvatten och börjar dehydrera frigörs dess eget antidiuretiska hormon (kallat vasotocin, en analog till VP) som får blåsans epitel att bli genomsläppligt för vatten. På så sätt återförs vatten som lagras i blåsan till blodet för att återfukta djuret. I princip bär paddan med sig sitt eget vatten på flaska i blåsan. Paddens urinblåsa blev därmed ett allmänt använt surrogat för att undersöka och förstå VP-inducerat vattenflöde över njurens samlingsgångsepitel .

I många år användes paddans urinblåsa för att undersöka hur VP:s verkan på vattenflödet över epitelcellerna börjar och avtar. Många cellulära signalvägar som reglerar denna process nedströms VP-receptorinteraktionen identifierades. Ett av de mest fascinerande resultaten som framkom i de många studierna av paddablåsan var konceptet med vattenkanaler som införs i dessa epitelcellers plasmamembran för att öka membranets och därmed epitelvattnets genomsläpplighet. När hormonerna drogs in skulle dessa ”vattenkanaler” sedan avlägsnas från plasmamembranet genom internalisering i cellen (en process som kallas endocytos), vilket återställde membranet till dess ursprungliga ogenomträngliga tillstånd och förhindrade vattenflödet. Denna idé publicerades av Wade som myntade termen ”skyttelhypotesen” för att beskriva vattenkanalernas fram- och återflyttning till och från cellytan i analogi med NASA:s rymdfärja. Men arten av dessa vattenkanaler förblev okänd.

Upptäckten av Aquaporin vattenkanaler

Trots många försök att identifiera proteinet som bildade vattenkanaler var området i stort sett fruset i tiden under många år. Alla riktade försök att isolera proteinet från renade membran av erytrocyter från paddablåsor och från njurar hade haft begränsad framgång, även om vissa publikationer kom nära och andra gav viktig information, t.ex. information om molekylstorlek (ca 30 kD) . Och så hände det att Agre-gruppen, när de undersökte Rhesusfaktorproteiner i röda cellmembran, noterade ett konsekvent ”kontaminerande” band på sina geler på cirka 28 kD . I stället för att förkasta denna information grävde de lite djupare och drog slutsatsen att detta kan vara den mycket eftersökta vattenkanalen i röda blodkroppar. Den isolerades och renades, och antikroppar visade att den också uttrycktes i celler i njurens proximala tubuli och Henles tunna nedåtgående gren – båda är konstitutivt mycket genomsläppliga för vatten. Kan detta vara vattenkanalen? Det avgörande ögonblicket kom när Agre-gruppen injicerade mRNA som kodade för detta protein i ett in vitro-expressionssystem, Xenopus oocyter. Oocytmembranet är normalt mycket ogenomträngligt för vatten – äggen placeras i sötvatten och skulle sprängas om membranet var genomträngligt! Men efter injektion av mRNA som kodar för den förmodade vattenkanalen gjorde oocyter som släpptes ner i destillerat vatten exakt det – de sprack, medan kontrolloocyter förblev intakta . Agre-gruppen insåg att det mRNA de injicerat hade tvingat oocyterna att producera ett nytt protein som, när det flyttades till oocytens membran med hjälp av cellulära transportmekanismer, gjorde att membranet blev mycket genomsläppligt för vatten. Mycket firande följde. En serie efterföljande artiklar bekräftade att detta nya protein, kallat CHIP28 (channel-forming integral membrane protein of 28 kD), var den första vattenkanal som slutgiltigt identifierats .

Aquaporinfamiljen

Snart efter det att den molekylära identiteten hos CHIP28 blev känd, hittade andra en rad homologa proteiner som bildade en ny familj. De blev kända som aquaporiner . När namnet användes för första gången fanns det fyra kända akvaporiner hos däggdjur – AQP1, 2, 3 och 4. Det finns nu 13 akvaporiner från däggdjur och hundratals har identifierats i andra organismer, inklusive växter. Alla dessa har samma övergripande strukturella egenskaper, med en molekylvikt på cirka 30 kD i den icke-glykosylerade formen, och flera olika glykosyleringstillstånd som resulterar i en högre molekylvikt. De bildar en funktionell tetramer i lipidbilagan och strukturen av vattenporten i proteinet har klarlagts med hjälp av röntgenkristallografi för några av akvaporinerna . Oväntat nog är vissa akvaporiner mer vattengenomsläppliga än andra, och vissa kan transportera andra molekyler utöver vatten. AQP3 är till exempel permeabel för glycerol och AQP9 är permeabel för urea. Dessutom är vissa akvaporiner permeabla för gaser som CO2 och NO . Fältet för akvaporinbiologi expanderar ständigt, och rapporter om nya och oväntade funktioner i olika celler och vävnader dyker upp med jämna mellanrum.

Aquaporin 1 och 2 (den VP-känsliga vattenkanalen) i njuren

AQP1, vattenkanalen för röda blodkroppar, uttrycks i hög grad i proximala tubuli och tunna nedåtgående Henle-led, som båda är mycket genomsläppliga för vatten vid alla tillfällen. Dessa tubulussegment är inblandade i reabsorptionen av 90 % av det filtrerade vattnet. En andra akvaporin, AQP2, identifierades i njurens huvudceller i samlingsgången . Det är dessa celler som (i likhet med paddablåsan) ändrar sin vattenpermeabilitet som svar på det antidiuretiska hormonet VP och därmed reglerar reabsorptionen av den återstående vätskan – nästan 20 liter per dag. AQP2 är den VP-reglerade vattenkanalen. I närvaro av VP ackumuleras AQP2 vid ytan av huvudcellerna och vatten passerar genom epitelet drivet av en osmotisk gradient (fig. 2). Den basolaterala aspekten av dessa tubuli är hypertonisk i förhållande till vätskan i tubularlumen och vatten strömmar nedåt längs denna gradient i närvaro av VP. Det basolaterala membranet i huvudcellerna är alltid vattenpermeabelt på grund av förekomsten av antingen AQP3 eller AQP4 i olika delar av njuren . Mängden AQP2 i det apikala membranet är således den hastighetsbegränsande faktorn som reglerar vattenreabsorptionen i njurens samlingsrör. Många års forskning har visat att AQP2 cirkulerar mellan plasmamembranet och cytoplasmatiska vesiklar i huvudcellerna, och VP förändrar jämvikten så att mer AQP2 ackumuleras vid cellytan och mindre finns inne i cellen, vilket förklarar ökningen av membranpermeabiliteten (fig. 2). Den cellbiologi som ligger till grund för denna process är delvis klarlagd och inbegriper en signalkaskad som initieras av VP-interaktion med sin receptor, aktivering av ett adenylylcyklas för att öka intracellulärt cAMP, aktivering av proteinkinas A och fosforylering av AQP2-proteinet. Fosforylering är den kritiska händelse som orsakar membranackumulering av AQP2, och flera laboratorier är involverade i studier som syftar till att ytterligare förstå denna process. Den intresserade läsaren hänvisas till de senaste detaljerade översikterna om denna process .

Akvaporinernas patofysiologi

Som man kan förvänta sig har aquaporiner involverats i flera sjukdomar, framför allt i njurarna (fig. 3). Funktionsfel eller mutationer i AQP2 eller, vanligare V2R, orsakar nefrogen diabetes insipidus (NDI), där patienterna inte kan koncentrera sin urin och teoretiskt sett skulle kunna tömma upp till 18 L utspädd urin varje dag, det vill säga den mängd som normalt återabsorberas i samlingsröret. På grund av andra kompensationsmekanismer producerar de flesta patienter med NDI mellan 5 och 10 l per dag. Tillgängliga behandlingar kan endast delvis lindra symtomen, och det krävs mer arbete för att hitta bättre botemedel. Den vanligaste orsaken till NDI är hos patienter som behandlas med litium för bipolär sjukdom. Litium orsakar en allvarlig nedreglering av AQP2-genen av skäl som inte är helt klarlagda . Även om det är en mycket effektiv behandling av bipolär sjukdom gör detta och andra biverkningar att många patienter tvekar att inleda en litiumbehandling. Andra AQP-relaterade sjukdomar, som mestadels identifierats i knockout-djursmodeller , är en urinkoncentrationsdefekt (AQP1-människor har identifierats), grå starr (AQP0), stroke (AQP4) och spröd hud på grund av defekt hydrering (AQP3). AQP1 och AQP2 har också involverats i cellmigration och sårläkning. Slutligen har akvaporinernas attraktionskraft väckt fantasi hos reklambyråer som till exempel är verksamma inom kosmetikaindustrin. Googla det och se!

Framtida riktningar

Ett spännande område inom akvaporinbiologin är uppkomsten av så kallade månglade funktioner hos dessa kanalproteiner. Dessa kan vara relaterade till deras kanalfunktion, som i fallet med gaspermeabiliteten hos AQP1, eller orelaterade till kanalaktiviteten som i fallet med AQP2, som är involverad i njurarnas utveckling via sin interaktion med integriner och den extracellulära matrisen . Framtida studier kommer utan tvekan att identifiera fler oväntade egenskaper hos akvaporinerna. Ett stort antal akvaporiner finns hos ”lägre” arter som inte är däggdjur, t.ex. växter, mikrober och svampar. Detta öppnar dörren för att använda denna information för att förbättra växters tillväxt och anpassning genom att stimulera AQP-funktionen och för att bekämpa mikrobiella infektioner och svampinfektioner genom att hämma akvaporiner. Sådana specifika hämmare finns ännu inte tillgängliga, men om och när de utvecklas skulle de också kunna få viktiga roller inom medicinen som akvaporiner (för att behandla högt blodtryck) och kanske inom cancer (för att blockera metastasering). Vi har också mycket att lära oss om cellbiologin för akvaporintrafikering. Hur flyttas de runt i cellen? Hur interagerar de med andra proteiner? Kan alternativa signalvägar identifieras och utnyttjas för att kringgå defekt V2R-signalering i NDI? Detta arbete pågår och lovar att avslöja cellulära hemligheter som inte bara gäller AQP-biologi utan även andra viktiga cellulära trafikeringshändelser som är inblandade i en mängd andra mänskliga sjukdomar.

Acknowledgements/Disclosure Statement

D.B. och hans kollegor i MGH:s program för membranbiologi har fått kontinuerligt stöd för arbete med aquaporiner från National Institutes of Health, för närvarande bidragsnummer DK096586. D.B. har från Danone Research fått ersättning för resekostnader och registreringsavgift för att delta i den vetenskapliga konferensen H4H.

Författarkontakter

Artikel/Publikationsdetaljer

Open Access License / Drug Dosage / Disclaimer

Denna artikel är licensierad under Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License (CC BY-NC-ND). Användning och distribution för kommersiella ändamål samt all distribution av modifierat material kräver skriftligt tillstånd. Läkemedelsdosering: Författarna och förlaget har gjort sitt yttersta för att säkerställa att läkemedelsval och dosering som anges i denna text överensstämmer med aktuella rekommendationer och praxis vid tidpunkten för publiceringen. Med tanke på pågående forskning, ändringar i statliga bestämmelser och det ständiga flödet av information om läkemedelsbehandling och läkemedelsreaktioner uppmanas läsaren att kontrollera bipacksedeln för varje läkemedel för att se om indikationer och dosering har ändrats och om varningar och försiktighetsåtgärder har lagts till. Detta är särskilt viktigt när det rekommenderade medlet är ett nytt och/eller sällan använt läkemedel. Ansvarsfriskrivning: De uttalanden, åsikter och uppgifter som ingår i denna publikation är enbart de enskilda författarnas och bidragsgivarnas och inte förlagets eller redaktörernas. Förekomsten av annonser och/eller produktreferenser i publikationen är inte en garanti, ett stöd eller ett godkännande av de produkter eller tjänster som annonseras eller av deras effektivitet, kvalitet eller säkerhet. Utgivaren och redaktören/redaktörerna avsäger sig allt ansvar för eventuella skador på personer eller egendom till följd av idéer, metoder, instruktioner eller produkter som det hänvisas till i innehållet eller annonser.