dNTP står för deoxyribosenukleotidtrifosfat och används i PCR för att utvidga den växande DNA-strängen. dATP, dTTP, dGTP och dTTP är fyra vanliga dNTP:er som används i PCR.
Funktionen hos dNTP:er i PCR är att utvidga den växande DNA-strängen med hjälp av Taq DNA-polymeras. Den binder till den komplementära DNA-strängen genom vätebindningar.
PCR är en in vitro-teknik för DNA-syntes. Syftet med att utföra PCR är att generera flera kopior av DNA-fragment av vårt intresse för att visualisera det under gelelektroforesen.
Syftet med PCR är att göra miljontals DNA-kopior för olika tillämpningar i efterföljande led som DNA-sekvensering eller DNA-mikroarray.
Polymeraskedjereaktionen är det oöverträffade verktyget som har använts inom den molekylärgenetiska forskningen sedan dess upptäckt. DNA-mall, primers, buffert, Taq DNA-polymeras och dNTPs är ingredienserna i PCR. För att förstå PCR:s mekanism måste vi lära oss betydelsen av varje ingrediens som används i den,
I den här artikeln diskuterar vi en av de viktigaste ingredienserna i PCR, nämligen dNTP:erna. Vi kommer också att titta på dess struktur och varför den är så viktig.
Vi kommer dessutom att tala om mekanismen för samverkan mellan dNTPs och Taq DNA-polymeras och deras arbete på den växande DNA-strängen.
Vi kommer dessutom att tala om mekanismen för hur dNTPs och DNA-polymeras samverkar och bidrar till att DNA-strängen växer.
Läs vidare om PCR-relaterade artiklar,
- Role of DMSO in PCR: DMSO är en PCR-förstärkare
- Funktionen hos taq DNA-polymeras i PCR
- Riktlinjer för utformning av primerer för PCR
- MgCl2:s roll i PCR-reaktionen
Nyckelämnen:
Vad är dNTPs?
DNTP:erna är de konstgjorda nukleotider som används i PCR för att syntetisera nya DNA-strängar på samma sätt som vid DNA-replikation. dATP, dTTP, dGTP, dTTP är vanliga nukleotider som finns i PCR-mastermixen.
Struktur för dNTP:er:
DNTP står för deoxyribose nukleotidtrifosfat.
För det första måste vi förstå flera grundläggande terminologier som bas, nukleotider, nukleosider, ribonukleotider, desoxiribonukleotider, desoxiribonukleotider, dideoxiribonukleotider för att förstå dNTPs. Detta är några grundläggande termer som används rutinmässigt inom genetiken, men som ändå missförstås av människor.
Adenin och guanin är purinbaser medan cytosin och tymin är pyrimidinbaser. Kvävebaser kan inte bilda DNA direkt. Fosfatryggrad och pentosocker krävs dessutom för att skapa en DNA-molekyl.
Nukleotiden består av ett pentosocker, fosfat och kvävebaser. En nukleotid binder till en annan intilliggande nukleotid med en fosfodiesterbindning medan en nukleotid binder till en annan nukleotid på den motsatta DNA-strängen med vätebindningar.
Bilden föreställer strukturen av desoxyribosetrifosfat, difosfat och monofosfat.
Läs mer om DNA:s struktur: DNA-historia: När fosfatet inte är kopplat till nukleotiden (eller saknas) kallas det för en nukleosid (nukleotid utan fosfat kallas det för en nukleosid).
När en väteatom ersätter hydroxylgruppen i pentossockret kallas sockret för ett deoxysocker. DNA består av deoxipentosocker medan RNA består av det enda ribosesockret.
DNTP:erna är en kedja av nukleotider som består av ribose, kvävebas och fosfat.
Det är dessutom så att ddNTP:erna skiljer sig från dNTP:erna.
Dideoxynukleotidtrifosfat har ingen fri 3′ OH-grupp, en annan 3′ OH-grupp i sockret är ersatt av väte.
Det kan därför inte orsaka expansion av en växande DNA-sträng. Dessa typer av ddATP, ddTTP, ddCTP och ddGTP används därför vid DNA-sekvensering. Vi kommer att diskutera ddNTPs roll vid sekvensering utförligt i en annan artikel.
De ddNTPs används i kedjeavslutningsmetoden för att stoppa expansionen av DNA-syntesen.
Bilden representerar skillnaden mellan ribosocker, deoxyribosocker och deoxyribosocker.
Trifosfatet består av tre olika fosfatmolekyler som utgör en ryggrad till DNA.
DNA:s fosfatryggrad består av tre olika fosfatmolekyler som kallas alfa-, beta- och gammafosfat. När en fosfat eller gammafosfat frigörs kallas strukturen för deoxynukleotiddifosfat.
Samma sak när två av de tre fosfaterna frigörs kallas strukturen för deoxynukleotidmonofosfat.
dATP och dGTP är puriner medan dCTP och dTTP är pyrimidin-dNTP som används i PCR-reaktioner. Funktionen hos dNTP:erna i PCR är densamma som vid replikation in vivo. Om du är intresserad av att läsa skillnaderna mellan nukleotider och nukleosider och puriner och pyrimidiner kan du läsa dessa artiklar:
- Puriner vs pyrimidiner
- Nukleotider vs nukleosider
Bilden föreställer fyra olika dNTPs struktur.
DNTPs funktion:
DNTPs är ingredienser i PCR, RT-PCR, DNA-sekvensering eller DNA-mikroarray som hjälper till att odla DNA eller förstärka DNA.
Verkningsmekanism:
Processen för PCR är uppdelad i tre temperaturberoende steg:
- Denaturering
- Annealing
- Extension.
I denatureringssteget denatureras det dubbelsträngade DNA:t till enkelsträngat DNA, i annealingsteget binder primern till den exakta positionen där dess komplementära sekvens finns och
i förlängningssteget lägger Taq DNA-polymeraset till dNTP:erna på den växande DNA-strängen.
När strängen har öppnats och primern binder till det enkelsträngade DNA:t börjar Taq DNA-polymeraset sin katalytiska aktivitet.
Taq DNA-polymeraset använder det enkelsträngade DNA:t som ett substrat för den enzymatiska aktiviteten och sätter sig på primer-DNA-övergången.
Den ena änden av Taq DNA-polymeraset binder nära 3′ OH-gruppen i oligonukleotidprimern, detta komplex kallas för P-DNA-komplex.
Bilden representerar DNA:s struktur med vätebindningar och DNA:s fosfodiesterbindning.
I nästa steg påbörjades dNTP-tillsättningen.
DNTP:n binder till P-DNA-komplexet med svag affinitet om den exakta komplementära nukleotiden är närvarande. Strax därefter håller Taq-dna-polymeraset fast den och vätebindningsinteraktionen mellan en komplementär bas och dNTP uppstår.
Här, i början, är det inte hela nukleotiden utan basen (kvävebasen) som finns på dNTP:n som avgör om den ska binda eller inte.
Först, om den hittar den komplementära basen på mallen ssDNA (A för T och G för C), kommer den att bilda vätebindningar mellan dem. Tre vätebindningar mellan C och G och två vätebindningar mellan A och T tillverkas.
När vätebindningen väl bildas, anpassar Taq DNA-polymeraset att bindningen av dNTP med den växande DNA-strängen genom att bilda en fosfodiesterbindning. Nu efter bildandet av fosfodiesterbindningen går Taq DNA-polymeraset ett steg framåt för att lägga till nya dNTP.
Fosfodiesterbindningen bildas mellan 3′ OH i primer och 5′ P i dNTP.
Efter bildandet av vätebindningen katalyserar Taq DNA-polymeraset reaktionen genom att ta bort gamma- och betafosfatet från dNTP:s trifosfat. Två pyrofosfater (PPi) frigörs efter avslutad reaktion.
Den exakta kinetiken för hur dNTP:erna och Taq-polymeraset interagerar under PCR-reaktionen är fortfarande inte känd.
Läs mer om en agarosgelelektrofores,
- Agarosgelelektrofores
- DNA-gelbeläggningsfärgämne
- EtBr:s roll i agarosgelelektrofores
Koncentrationen av dNTP:er i PCR:
I allmänhet räcker det med 200μM av varje dNTP för PCR-reaktioner med 30 till 35 cykler i en körning.
200μM vardera vilket innebär att totalt 800μM av 4 dNTPs-blandningar används i en enda PCR-reaktion. Vi måste förbereda vår arbetskoncentration från stamlösningen på 100mM.
Hursomhelst är färdiga mastermixer på senare tid mycket populära och effektiva. Den färdiga mastermixen innehåller alla viktiga ingredienser, t.ex. dNTPs mix, gel loading dye och Taq DNA-polymeras.
Som vetenskapsstudent måste vi lära oss hur man förbereder arbetslösningen från lagret. Anta att vi måste förbereda 2 mM arbetslösning från 100 mM lagerlösning.
Nu,
Håller du reda på V1C1= V2C2?
Här är den givna koncentrationen C1 100mM (vilket är lagerkoncentrationen av dNTPs)
V1 är den givna volymen är okänd (?)
C2 är erforderlig koncentration = 2mM
V2 är erforderlig volym= 1000μL
Nu är V1C1= V2C2
V1= V2C2/ C1
V1= 1000 * 2/ 100
V1= 20μL
Här, 20μL av varje dNTPs behövs för beredningen av arbetslösningen så den slutliga volymen för vår blandning är 80μL av (dATP, dCTP, dGTP och dTTPTP) i 920μL D/W.
Detta ger en slutlig koncentration på 2mM av varje dNTP i 1000μL arbetslösning. Beräkna själv för 200μM.
Min ultimata guide för användning av dNTPs i PCR
Förbered alltid två stamlösningsrör och förvara alla rören vid -20°C.
Beräkna hur många reaktioner du utför på en vecka och förbered följaktligen arbetslösningen från stamlösningen och förvara den vid 4°C. Eftersom upprepad frysning och upptining minskar dNTPs aktivitet.
Vid beredning av arbetslösningen ska du alltid bära glödlampor och upprätthålla sterila förhållanden, eftersom kontaminering av främmande DNA kommer att hindra PCR-reaktionen.
Den 200μM koncentrationen är tillräcklig för PCR-reaktion, men för PCR med lång räckvidd kan dock 2mM till 3 mM koncentration av varje dNTP användas.
När koncentrationen av dNTPs ökar kommer hastigheten för ospecifik bindning att öka. På samma sätt leder bristen på dNTPs till ofullständiga PCR-produkter. Använd därför alltid en lämplig mängd dNTPs.
Slutsats:
Det kan konstateras att dNTP:s funktion i PCR-reaktionen är lika viktig som Taq DNA-polymeras.
Med hjälp av Taq binder dNTPs till den växande DNA-strängen och expanderar den. Om du inte vill krångla med alla dessa saker kan du använda färdiga PCR-kit som är mer att föredra. Ändå måste du lära dig den manuella metoden för beredning av reagens.