Fruktvätska och fostermembranstamceller: Marker Discovery

Abstract

Fruktvätska (AF) och fostermembran (AM) har nyligen karakteriserats som lovande källor till stam- eller progenitorceller. Båda innehåller inte bara subpopulationer med stamcellsegenskaper som liknar vuxna stamceller, t.ex. mesenkymala stamceller, utan uppvisar också vissa embryonala stamcellsegenskaper som i) uttryck av pluripotensmarkörer, ii) hög expansion in vitro eller iii) multilinead differentieringsförmåga. På senare tid har man fokuserat på isolering och detaljerad karakterisering av dessa stamcellstyper. Variationer i deras fenotyp, deras heterogenitet som beskrivs av olika grupper och avsaknaden av en enda markör som uttrycks endast i dessa celler kan dock förhindra isolering av en ren homogen stamcellspopulation från dessa källor och deras potentiella användning av dessa celler i terapeutiska tillämpningar. I den här artikeln syftar vi till att sammanfatta de senaste framstegen när det gäller upptäckt av markörer för stamceller som härrör från fetala källor som AF och AM, med hjälp av nya metoder baserade på transkriptomik, proteomik eller sekretomanalyser.

1. Introduktion

Både fostervatten (AF) och fostermembran (AM) utgör rika källor till stamceller som i framtiden kan användas för kliniska terapeutiska tillämpningar. De etiska frågorna om isolering av stamceller från dessa källor är minimala, i motsats till de frågor som uppstår i samband med forskning om mänskliga embryonala stamceller (ESC). AF samlas in i samband med planerade fostervattenprov mellan den 15:e och 19:e graviditetsveckan för fosterdiagnostik, och det överflödiga provet kan användas för att ta fram celler, medan AM vanligen samlas in i samband med kejsarsnitt i samband med terminsgraviditeter. Eftersom stamcellspopulationerna från dessa källor är heterogena är det svårt att isolera specifika celltyper och det krävs en detaljerad fenotypisk och molekylär karakterisering av respektive celler. Studier som innefattar omikiska metoder är grundläggande för att bättre förstå mekanismerna för dessa cellers molekylära uttryck och för att definiera korrekta metoder för deras isolering, innan de används i terapeutiska metoder.

Denna artikel syftar till att presentera de viktigaste biologiska och molekylära egenskaperna hos stamceller som härstammar från AF och AM och även till att belysa de senaste framstegen i upptäckten av markörer med hjälp av globala metoder, såsom transkriptomik, proteomik eller sekretomanalyser.

1.1. Fostervatten

AF fungerar som en skyddande vätska för det embryo som utvecklas och ger mekaniskt stöd och nödvändiga näringsämnen under embryogenesen . Amniocentes har under många årtionden använts som ett rutinförfarande för karyotypering av foster och prenatal diagnostik, vilket gör det möjligt att upptäcka en rad olika genetiska sjukdomar.

Flödesvätskans huvudsakliga beståndsdel är vatten, men dess totala sammansättning varierar under hela graviditeten. I början av graviditeten är den amniotiska osmolariteten likartad med den fetala plasman. Efter keratinisering av fosterhuden minskar den amniotiska osmolariteten relativt till mödra- eller fosterplasma, främst på grund av inflödet av fosterurin . Mer intressant är att AF också utgör en rik källa till en stamcellspopulation som härrör från antingen fostret eller det omgivande fosterhinnan . Ytterligare undersökningar av flera grupper har nyligen inriktats på de cellulära egenskaperna hos amniotiska celler och deras potentiella användning i prekliniska modeller och i transplantationsbehandlingar.

1.1.1.1. Fostervattenstamceller (AFSCs)

Förlossningsvätskecellerna (AFCs) utgör en heterogen population som härstammar från de tre könsskikten. Dessa celler delar ett epiteliskt ursprung och härstammar antingen från det embryo som håller på att utvecklas eller från den inre ytan av fosterhinnan, som karakteriseras som fostermembranstamceller . AFC består huvudsakligen av tre grupper av vidhäftande celler, som kategoriseras utifrån sina morfologiska, tillväxtmässiga och biokemiska egenskaper . Epitelioida celler (E-typ) är kuboidala till kolonnformiga celler som härstammar från fosterhud och urin, fostervattenceller (AF-typ) har sitt ursprung i fostermembranen och fibroblastiska celler (F-typ) genereras huvudsakligen från fibrös bindväv. Både AF- och F-typceller delar en fibroblastoid morfologi och den dominerande celltypen verkar vara AF-typen, som samuttrycker keratiner och vimentiner . Flera studier har dokumenterat att stamceller från mänsklig fostervatten (AFSC) lätt kan erhållas från en liten mängd AF från andra trimestern, som samlas in under rutinmässiga fostervattenprovtagningar, ett förfarande med en spontan abortfrekvens på mellan 0,06 och 0,5 % . Hittills har ett antal olika odlingsprotokoll rapporterats, som leder till anrikade stamcellspopulationer. Isolering av AFSC och respektive odlingsprotokoll sammanfattades i en nyligen publicerad översikt av Klemmt et al. och kan kategoriseras enligt följande: (i) ett odlingsprotokoll i ett enda steg, där den primära kulturen lämnades ostörd i 7 dagar eller mer tills de första kolonierna uppträdde , (ii) ett odlingsprotokoll i två steg, där amniocyter, som inte fästes efter 5 dagar i odling, samlades in och expanderades ytterligare , (iii) selektion av cellytemarkerare för CD117 (c-kit-receptor) , (iv) mekanisk isolering av de initiala mesenkymala progenitorcellkolonier som bildats i de initiala odlingarna , och (v) kortvariga odlingar för att isolera fibroblastoida kolonier . Majoriteten av de AFSC som isolerades enligt dessa metoder delade en multipotent mesenkymal fenotyp och uppvisade en högre proliferationspotential och en bredare differentieringspotential jämfört med vuxna MSCs .

1.2. Fostermembran (AM)

Förlossningsmembranet, som saknar kärlvävnad, utgör större delen av det inre lagret av fostermembranet och består av tre lager: (i) ett epitelmonolager bestående av epitelceller, (ii) ett acellulärt intermediärt baslager och (iii) ett yttre mesenkymalt cellskikt, rikt på mesenkymala stamceller och placerat i nära anslutning till chorion . AM har använts på kliniken i många årtionden för sårläkning vid brännskador, för att främja epitelbildning och skydda mot infektioner . På senare tid har användningen av AM utvärderats som ett sårförbandsmaterial för kirurgiska defekter i munslemhinnan, rekonstruktion av ögonytan, hornhinneperforationer och blåsförstoring.

1.2.1. Amniotiska membranstamceller (AMSC)

Amniotiska membranstamceller (AMSC) omfattar två typer, amniotiska epitelceller (AEC) och amniotiska mesenkymala stamceller (AM-MSC) som härstammar från det amniotiska epitelskiktet respektive det amniotiska mesenkymala skiktet . Båda celltyperna har sitt ursprung under pregastrulationsstadiet hos det embryo som håller på att utvecklas, före avgränsningen av de tre primära könsskikten, och de är mestadels av epitelkaraktär . En rad olika protokoll har upprättats för isolering av AEC och AM-MSC, som främst bygger på mekanisk separation av AM från chorionmembranet och efterföljande enzymatisk nedbrytning . AM-MSCs uppvisade plastisk vidhäftning och en fibroblastoid morfologi, medan AECs uppvisade en epitelisk fenotyp av kullerstenstyp. AM-MSCs hade liknande fenotypiska egenskaper som de som härstammar från vuxna källor. Mer intressant är att AM-MSC, i likhet med AF-MSC, uppvisade en högre proliferationshastighet jämfört med MSC som härstammar från vuxna källor och en potential för differentiering i flera led till celler som härstammar från de tre könsskikten.

2. Immunfenotyp

2.1. Stamceller från fostervatten

Flödesvätskan har nyligen framstått som en alternativ fosterkälla för en mängd olika celler med stamcellsursprung . Här syftar vi till att sammanfatta de viktigaste markörerna som kännetecknar AFSC. Hittills utgör MSCs den bäst karakteriserade subpopulationen av AFSCs. AF-MSC uppvisade typiska mesenkymala marköruttryck, t.ex. CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58 och CD44, fastställda genom flödescytometrianalyser . Dessutom uttryckte dessa celler HLA-ABC-antigenet, medan uttrycket av de hematopoetiska markörerna CD34 och CD45, endotelmarkören CD31 och HLA-DR-antigenet inte upptäcktes . Viktigare är att majoriteten av odlade AF-MSC uttryckte pluripotensmarkörer som octamerbindande protein 3/4 (Oct-3/4), homebox-transkriptionsfaktorn Nanog (Nanog) och det stadiespecifika embryonala antigenet 4 (SSEA-4) .

Det rapporterades också att amniocytkulturer innehåller en liten population av CD117-positiva celler (ett tyrosinkinaspecifikt tyrosinkinas som är specifikt för stamcellsfaktorn och som främst finns i ESC:er och primitiva könsceller) som kan expanderas klonalt i kultur. Differentieringsegenskaperna hos CD117+ AFS testades för första gången in vivo, vilket bevisar deras stamcellsidentitet . Experimentella bevis tyder på att AFSC härstammar från spindelformade fibroblastoida celler .

I ett försök att analysera AFSC-subpopulationerna har vår grupp nyligen identifierat två morfologiskt distinkta populationer av AFSC av mesenkymalt ursprung, med olika proliferations- och differentieringsegenskaper, som benämns som spindelformade (SS) och rundformade (RS) . Båda subpopulationerna uttryckte mesenkymala stamcellsmarkörer på liknande nivåer. Det konstaterades dock att SS-kolonier uttryckte högre nivåer av CD90- och CD44-antigenerna jämfört med RS-kolonier.

2.2. Amniotiska membranstamceller (AMSC)

En detaljerad immunfenotypanalys av AMSC visade att antigener som CD13, CD29, CD44, CD49e, CD54, CD73, CD90, CD105, , CD166, , stromal stamcellsmarkör 1 (Stro-1), SSEA-3, SSEA-4, kollagen I och III (Col1/Col3), alfa-smooth muscle actin (α-SMA), CD44, vimentin (Vim), fibroblast surface protein (FSP) och HLA-ABC-antigen . Intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) uttrycktes dock i mycket låga nivåer och proteinerna TRA-1-60, vascular cell adhesion protein 1 (VCAM-1), von Willebrand factor (vWF), platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1), CD3 och HLA-DR påvisades inte . Ett av de mest frekventa proteinerna i celler från AM är laminin, som spelar en viktig roll för differentiering, cellform och migration samt vävnadsregeneration . RT-PCR-analys visade vidare att AMSC uttryckte gener som Oct-3/4, zinkfingerprotein 42 (zfp42 eller Rex-1), stamcellsfaktorprotein (SCF), neuralcellsadhesionmolekyl (NCAM), nestin (NES), benmorfogenetiskt protein 4 (BMP-4), GATA-bindningsprotein 4 (GATA-4) och hepatocytkärnfaktor 4α (HNF-4α), även i höga passager. Transkript av Brachyury, fibroblast growth factor 5 (FGF5), paired box protein (Pax-6) och bone morfogenetic protein 2 (BMP2) kunde inte påvisas. På samma sätt var AEC positiva för CD10, CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC och negativa för CD14, CD34, CD45, CD49d och HLA-DR-uttryck, vilket fastställdes genom FACS-analyser . Ytterligare undersökningar visade att AECs uttryckte stamcellsmarkörer som SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, könsbestämmande region Y-box 2 (Sox2), Tra1-60 och Tra1-80, fibroblast growth factor 4 (FGF4), Rex-1, cryptic protein (CFC-1) och prominin 1 (PROM-1) .

3. Transkriptomik

3.1. Amniotic Fluid Stem Cells

En funktionell analys av genuttryckssignaturen hos AF-MSCs jämfört med benmärgs- (BM-), cord-blood- (CB-) och AM-MSCs utfördes ursprungligen av Tsai et al. . Gener som uttrycks i MSC från alla tre källor kunde kategoriseras i grupper som rör i) extracellulär matrisremodellering (CD44, kollagen II (COL2), insulinliknande tillväxtfaktor 2 (IGF2), och vävnadsinhibitor av metalloproteinas 1 (TIMP1)), ii) reglering av cytoskelettet (plasminogenaktivator av urokinas-typ (PLAU) och receptor (PLAUR)), iii) reglering av kemokiner och vidhäftning (alfaaktinin 1 (ACTN1), aktinrelaterat proteinkomplex underenhet 1B (ARPC1B) och trombospondin 1 (THBS1)), iv) plasminaktivering (vävnadsfaktorvägsinhibitor 2 (TFPI2)), (v) signalering av transforming growth factor β (TGFβ)-receptorerna (caveolin 1 (Cav1), caveolin 2 (Cav2), cyklinberoende kinashämmare 1A (CDKN1A)), och (vi) gener som kodar för E3 ubiquitinligaser (SMURF) . De uppreglerade generna i AF-MSC jämfört med BM-, CB- och AM-MSC omfattade molekyler som är involverade i livmoderns mognad och kontraktion, t.ex. oxytocinreceptorn (OXTR) och reglering av prostaglandinsyntesen, t.ex. fosfolipas A2 (PLA2G10). Andra uppreglerade gener i denna grupp var involverade i signaltransduktion relaterad till i) trombinutlöst svar ((F2R och F2RL)), ii) hedgehog-signalering ((hedgehog acyltransferas (HHAT)) och iii) G-protein-relaterade vägar (rho-relaterat GTP-bindande protein (RHOF), regulator av G-protein-signalering 5 och 7 (RGS5, RGS7) och fosfolipas C beta 4 (PLCB4)) .

I nyligen genomförda studier av AFSC beskriver Kim et al. för första gången genuttrycksförändringar i den totala AFSC-populationen under olika passager genom illumina-mikroarrayanalys. 1970 differentiellt uttryckta gener upptäcktes och kategoriserades enligt sina uttrycksprofiler i 9 olika kluster . Gener med gradvis ökande uttrycksnivåer omfattade kemokin (C-X-C-motiv) ligand 12 (CXCL12), cadherin 6 (CDH6) och folatreceptor 3 (FOLR3). Nedreglerade gener var bland annat cyklin D2 (CCND2), keratin 8 (K8), IGF2, natriuretisk peptidprekursor (BNP) B och cellulärt retinosyrabindande protein 2 (CRABPII) . För att få ytterligare information utfördes en analys av chipdata om åldrande gener som visade på en uppreglering av gentranskripter, t.ex. nervtillväxtfaktor beta (NGFβ), insulinreceptorsubstrat 2 (IRS-2), insulinliknande tillväxtfaktorbindningsprotein 3 (IGFBP-3) och apolipoprotein E (APOE). Uttryck av gener, t.ex. PLAU, E2F-transkriptionsfaktor 1 (E2F1), IGF2, BRCA1 (BRCA1), BRCA1 (BRCA1), DNA-topoisomeras 2-alpha (TOP2A), PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), forkhead box M1 (FOXM1), cyklin-A2-genen (CCNA2), budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta (BUB1B) och cyklinberoende kinas 1 (CDC2), gradvis nedreglerades under odlingen.

Wolfrum et al. utförde en global genuttrycksanalys av AFSCs jämfört med iPSCs från AF (AFiPSC) och ESCs . Bland dessa gener är gener relaterade till självförnyelse och pluripotens (1299 gener, t.ex. POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), Sox2, Nanog, microRNA-bindande protein LIN28) och AFSC-specificitet (665 gener, t.ex, OXTR, HHAT, RGS5, neurofibromatos typ 2 (NF2), protectin (CD59), tumörnekrosfaktor superfamiljemedlem 10 (TNFSF10), 5′-nukleotidas (NT5E))) upptäcktes i AFSC. Författarna undersökte dessutom uttrycket av senescens- och telomerrelaterade gener i AFSCs av tidig och senare passage, för att studera effekten av omprogrammering för att kringgå senescens som observerats i AFSC-kulturer. Sextiofyra gener identifierades som differentiellt uttryckta i AFSC jämfört med AFiPSC-linjer. Av dessa var telomerassocierade gener och gener som är involverade i regleringen av cellcykeln, t.ex. mitotic arrest deficient-like 2 (MAD2L2), poly ADP-ribose polymerase 1 (PARP1), replikationsprotein A3 (RPA3), dyskeratosis congenita 1 (DKC1), mutS homolog 6 (MSH6), CHK1 checkpoint homolog (CHEK1), polo-like kinase 1 (PLK1), POU class 2 homeobox 1 (POU2F1), CDC2, Bloom-syndromets gen RecQ helicase-like (BLM), Werner-syndromets RecQ helicase-like (WRN), DNA-metyltransferas 1 (DNMT1), DNA-metyltransferas 3 beta (DNMT3B), lamin B1 (LMNB1) och DNA-replikeringsfaktor 1 (CDT1), var nedreglerade i AFSC jämfört med AFiPSC och ESC. Däremot var peptidylprolyl cis/trans isomeras (PIN1), lamin A/C (LMNA), growth arrest and DNA damage inducible alpha (GADD45A), chromobox homolog 6 (CBX6), NADPH-oxidas 4 (NOX4), endoglin (ENG), histon H2B typ 2-E (HIST2H2BE), CDKN1A, CDKN2A, tillväxtdifferentieringsfaktor 15 (GDF15) och serinproteashämmare 1 (SERPINE1), bland annat, var uppreglerade i AFSC jämfört med AFiPSC och ESC.

3.2. Amniotiska membranstamceller

Transkriptomisk analys med hjälp av DNA-mikroarrays har rapporterats för AM-MSCs . Dessa experimentella data gav information om AM-MSC:s genuttrycksmönster jämfört med genuttrycksprofiler från AF-, CB- och BM-MSC:s. Flera uppreglerade gener i AM-MSC som är involverade i reglering av immunanpassning mellan moder- och moderkaksgränsen identifierades. Bland annat spondin 2 (SPON2), interferon alfa-inducerbart protein 27 (IFI27), bradykinininreceptor B1 (BDKRB1), små inducerbara cytokiner i underfamiljen B medlem 5 och 6 (SCYB5, SCYB6) och Yamaguchi sarcoma viral-relaterad onkogen homolog (LYN) visade sig vara uppreglerade. Andra gener med ökat uttryck i AM-MSC jämfört med AF-, CB- och BM-MSC omfattade i) transkriptionsfaktorer, t.ex. forkhead box F1 (FOXF1), heart and neural crest derivatives expressed 2 (HAND2) och transkriptionsfaktor 21 (TCF21) och ii) metabola enzymer, t.ex. dipeptidylpeptidas 6 (DPP6), tryptofan 2,3-dioxygenas (TDO2) och sialyltransferaser (STs) .

4. Proteomik

4.1. Fostervattenstamceller

Proteomiska studier av den totala AFSC-populationen, inklusive epitelioida (E-typ), fostervattenspecifika (AF-typ) och fibroblastiska (F-typ) celler, avslöjade 2400 fläckar som resulterade i identifiering av 432 olika genprodukter. Majoriteten av proteinerna lokaliserades i cytoplasma (33 %), mitokondrier (16 %) och kärnan (15 %) och representerade huvudsakligen enzymer (174 proteiner) och strukturella proteiner (75 proteiner). En relativt hög andel membran- och membranassocierade proteiner förekom också (7 %) . Av de påvisade proteinerna motsvarade 9 proteiner epitelceller, t.ex. ATP-syntas D-kedja (ATP5H), NADH-ubiquinonoxidoreduktas 30 kDa-underenhet (NUIM), annexin II (Anx2), annexin IV (Anx4), 40S ribosomalt protein SA (Rpsa), glutation S-transferas P (GSTP), major vault protein och cytokeratinerna 19 och 7 (CK-19, CK-7), medan 12 proteiner rapporterades uttryckas i fibroblaster, däribland fibronectiner, tropomyosiner, transgelin (TAGLN), arp2/3-komplexets 34 kDa-underenhet (P34-arp), gelsolin (Gsn), förlängningsfaktor 1-β (EF-1β) och andra. Åtta proteiner visade sig uttryckas i keratinocyter, inklusive keratiner, ribonukleoproteiner, Anx2, aetyl-CoA acetyltransferas (ACAT1) och andra, tre uttrycktes i epidermis, inklusive tropomyosiner och keratiner, och ett i mesenkymal celltyp (vimentin 1 (Vim 1)) .

Nyligen genomförda studier gav belägg för att en mångfald av metaboliska enzymuttryck i amnioncellerna är involverade i metaboliska och genetiska syndrom, och därför kan deras upptäckt vara viktig för prenatal diagnostik. En mer detaljerad analys för att bestämma specifika metaboliska enzymer som finns i AFSC rapporterades av Oh et al. . Nittionio proteiner hade identifierats, såsom kolhydrathanterande enzymer, aminosyrahanteringsenzymer, proteiner för purinmetabolism och enzymer för intermediärmetabolism .

En proteomisk analys utfördes också på olika odlingspassager av CD117+ AFSC, som uppvisade variationer i proteinexpressionen som främst förekom i tidiga passager . Tjugotre proteiner uttrycktes differentiellt mellan tidiga och sena passager med de mest fasthållande nedreglerade proteinerna, Col1, Col2, vinculin (Vcl), CRABP II, stathmin (STMN1) och cofilin-1 (CFL1). Däremot ökar TAGLN och Col3 under passage . Proteiner som uppvisade dysreglerade nivåer längs passagerna var 26S-proteasreglerande underenhet 7 (PSMD7), ubiquitinkarboxylterminalhydrolasets isoenzym L1 (UCH-L1), det heterogena nukleära ribonukleära proteinet H (hnRNP H) och TAR DNA-bindande protein 43 (TDP-43) .

År 2007 konstruerades den proteomiska kartan över mänskliga AF-MSCs och jämfördes direkt med den som härrörde från BM-MSCs . 261 olika proteiner identifierades i AF-MSC med majoriteten av proteinerna lokaliserade i cytoplasman (41 %), medan andra återfanns i endoplasmatiska retikulet (8 %), kärnan (13 %), mitokondrier (12 %), ribosomer (1 %), cytoskelett (6 %), cytoplasma och kärnan (5 %), och utsöndrade (2 %) proteiner . AF-MSC uttryckte ett antal proteiner relaterade till proliferation och cellunderhåll, t.ex. ubiquilin-1 (UBQLN1), som är känt för att kontrollera cellcykelutveckling och celltillväxt, det proliferationsassocierade proteinet 2G4 (PA2G4), ett nukleolärt tillväxtreglerande protein, det sekretade protein som är surt och rikt på cystein (SPARC), som regleras under embryogenesen och är involverat i kontrollen av cellcykeln och celladhesion, och enhancer of rudimentary homolog (ERH) som också reglerar cellcykeln . TAGLN och galectin 1 (Gal 1), som båda finns i stamceller och är relaterade till differentiering, uttrycktes också rikligt i AF-MSC. Andra proteiner som uttrycktes i höga nivåer i AF-MSC var relaterade till i) utveckling, t.ex. Deltex-3-liknande (DTX3L), och ii) cytoskelettorganisation och rörelse, t.ex. CFL1, det koaktosinliknande proteinet (CLP) och det aktiverade proteinhomologet (Enah). Som förväntat uttrycktes Vim också i stora mängder i AF-MSC. I denna studie beskrevs också en detaljerad jämförelse av de gemensamma identifierade proteinerna i AF-celler och AF-MSCs .

I vår senare studie , upprättade vi den proteomiska kartläggningen av de två morfologiskt distinkta AF mesenkymala progenitorcelltyperna (SS och RS) med hjälp av 2-DE. Tjugofem proteiner var differentiellt uttryckta i de två subpopulationerna. Proteiner som uppreglerades i SS-AF-MSC jämfört med RS-AF-MSC omfattade retikulokalbin-3-prekursor (RCN3), kollagen α1 (I) (COL1α1), FK506-bindande protein 9-prekursor (FKBP9), Rho GDP-dissocieringshämmare 1 (RhoGDI), klorid intracellulärt kanalprotein 4 (CLIC4), tryptofanyl-tRNA-syntetas (TrpRS) och 70 kD värmeschockprotein (HSP70). Peroxiredoxin 2 (Prdx2), 60 kD värmeschockprotein (HSP60), GSTP och Anx4 var uppreglerade i RS-AFMPCs. De proteiner som identifierades i RS-AF-MSCs omfattade dock endast cytokeratin-8, -18 och -19 (CK-8, -18 och CK-19), kathepsin B (CTSB), CLP och integrin αV-protein (CD51). Mesenkymalrelaterade proteiner, såsom Vim, Gal, Gsn och prohibitin (PHB), uttrycktes på samma nivåer i båda populationerna .

4.2. Amniotiska membranstamceller

En detaljerad metod för att studera mänskliga AM-proteiner beskrevs av Hopkinson et al. . I denna studie utförde författarna en proteomisk analys av AM-prover som förberetts för mänsklig transplantation, med hjälp av 2-DE-geler. Tvättmedierna från AM-proverna undersöktes också och de utsöndrade proteinerna identifierades. Proteiner som upptäcktes både i AM och i tvättmedierna tydde på att en partiell frisättning av proteiner hade skett. Dessa proteiner var mestadels lösliga cytoplasmaproteiner och kategoriserades enligt deras subcellulära lokalisering och funktion . Ett exempel på de mest förekommande och konsekventa proteinerna i AM är THBS1 som rapporteras spela en roll vid sårreparation, inflammatorisk reaktion och angiogenes . Mimecan (även kallat osteoglycin/OGN) är ett annat protein som upptäckts i AM och som representerar en liten leucinrik proteoglykan som finns i bindvävens ECM. Mimecan rapporteras bibehålla vävnadens draghållfasthet och hydrering. Dessutom uttrycktes den större formen av mimekan i AM-celler och var mottaglig för proteolytisk klyvning . TGF-β-inducerat protein ig-h3 (βIG-H3), en ECM-adhesiv molekyl som fungerar som en membranassocierad tillväxtfaktor under celldifferentiering och sårläkning, och intergrin α6 (CD49f), en komponent i α6β4-integrin, fanns också i betydande mängder i AM-celler . Det är väl känt att α6β4-βIG-H3-interaktionen spelar en viktig roll för att förmedla celladhesion och signalvägar för sårreparation .

En annan viktig studie av Baharvand et al. var inriktad på analysen av epiteldenudierad mänsklig AM som visade både kvantitativa och kvalitativa skillnader jämfört med obehandlad AM . De undersökte proteomet i det mänskliga AM-epitelet, som användes som en limbisk stamcellsnisch för behandling av rekonstruktion av ögonytan . 515 fläckar upptäcktes i alla 2-DE-geler och 43 proteiner identifierades med hjälp av MALDI TOF/TOF MS i AM. De mest förekommande proteinerna var olika isoformer av lumikan (LUM) och OGN, som båda tillhör proteoglykanfamiljen (PG). Särskilt OGN kan spela en roll i många biologiska processer, inklusive celltillväxt, angiogenes och inflammation. Andra proteiner som upptäcktes var kollagen VI α-1/α-2 (Col6a1/Col6a2), fibrinogen betakedja (FGB), transglutaminas 2 isoform A (TGM2A), b-actinvariant (ACTB), 70 kD värmeschockprotein 5 (HSPA5), nidogen 2 (NID2), CD49f, βIG-H3 och tubulointerstitiell nefrit (TIN) . Några av de proteiner som identifierades i denna studie var också relaterade till den extracellulära matrisen (ECM). Bland de upptäckta proteinerna rapporterades fibronectin (FN), lamininer samt kollagen IV (Col4) och VII främja epitelisk vidhäftning och migration .

5. Sekretom

Nyligen har betydande framsteg gjorts när det gäller analysen av de sekretade proteinerna från AFSC. Det har dokumenterats att AFSC-sekretomet var ansvarigt för att öka vaskulogenesen och kunde framkalla ett starkt angiogent svar hos murina mottagare . Enligt den här studien avslöjade en detaljerad analys av AFSC-konditionerade medier förekomsten av kända proangiogena och antiangiogena faktorer med hjälp av Luminex MAP-teknik. Vascular endothelial growth factor (VEGF), stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), interleukin 8 (IL-8), monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) och två angiogeneshämmare, interferon-gamma (IFNγ) och interferon-gamma-inducerat protein 10 (IP-10), identifierades som utsöndrade proteiner . Det visades också att ett relativt litet antal AFSC var tillräckligt för att utsöndra en påvisbar mängd proangiogena tillväxtfaktorer och cytokiner. Sekretionen av dessa kan regleras på ett dosberoende sätt beroende på det ursprungliga antalet celler som används .

En systematisk studie av AFSC-sekreterade proteiner ledde till slutsatsen att proangiogena lösliga faktorer från AFSC kan förmedla rekryteringen av endotelprogenitorer i en ischemisk råttmodell . I synnerhet kunde konditionerat medium från AFSCs topiskt leverera angiogena tillväxtfaktorer och cytokiner till hudfliken i den ischemiska råttmodellen och var ansvarig för att utlösa den endogena reparationen genom att rekrytera endoteliska progenitorceller .

I våra nyligen genomförda studier undersökte vi den terapeutiska potentialen hos AF-MSCs och deras utsöndrade molekyler hos möss med akut leversvikt . En mängd cytokiner och tillväxtfaktorer upptäcktes i AF-MSC konditionerat medium. Cytokiner som interleukin 10 (IL-10), interleukin 27 (IL-27), interleukin 17-familjen (IL-17E), interleukin 12p70 (IL-12p70), interleukin-1 beta (IL-1β) och interleukin-1-receptorantagonist (IL-1ra), som är ansvariga för att inducera lokal och systemisk nedreglering av proinflammatoriska mediatorer, upptäcktes. SERPINE1, MCP-1 och SDF-1, som är ansvariga för att främja vävnadsreparation, utsöndrades också. Intressant nog fanns bland de högt uttryckta tillväxtfaktorerna platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF), endostatin/collagen XVII (EN/Col17), urinplasminogenaktivator (uPA), TIMP1, TIMP2, heparinbindande EGF-liknande tillväxtfaktor (HB-EGF), fibroblast growth factor 7 (FGF7) och epidermal growth factor (EGF), som ansvarar för leverregenerering och vävnadsreparation .

6. Sammanfattning

De nuvarande uppgifterna hittills tyder på att fostervatten och fostermembran kan utgöra lovande källor för stamceller av mesenkymalt ursprung. MSC är i själva verket mer rikligt förekommande och ett stort antal protokoll har beskrivits för deras isolering. Det rapporteras dock att olika odlingsförhållanden för samma typ av celler kan påverka deras differentiella genuttrycksmönster, vilket utgör en begränsning för deras isolering och expansion in vitro. Studier som omfattar fenotypisk analys med hjälp av metoder som flödescytometri och immunohistokemi samt transkriptomik, proteomik och sekretomanalyser syftar till att fastställa proteinprofilen hos dessa celler (figur 1). De data som genereras genom sådana studier förväntas klargöra deras differentiella repertoar och validera den molekylära profilen hos dessa stamceller. Den viktigaste frågan som måste lösas är dock att isolera en homogen population som kan underlätta systematiska studier för att klarlägga funktionen hos dessa multipotenta celler.

Figur 1

Sammanfattning av de viktigaste markörerna som identifierats i AFC och AMC med hjälp av transkriptomik-, proteomik-, sekretom- och immunofenotypiska analyser. Proteiner som identifierats i mer än en studie är markerade med fet stil.

Dessa metoder kan leda till identifiering av viktiga antigener som speglar fenotypen hos dessa celler och förklarar deras distinkta egenskaper. Denna typ av studier kommer att öppna vägen för en systematisk och effektiv isolering av dessa celler innan de används i den kliniska miljön.

Anhang

Frågor för ytterligare undersökningar

Vilka är de lämpliga isoleringsmetoderna och odlingsförhållandena för AFSCs eller AMSCs som gör det möjligt att identifiera en konsekvent fenotyp?

Innehåller det en enda markör som kan användas för isolering av AFSC eller AMSC?

AfSC- och AMSC-populationerna är heterogena och skiljer sig åt i fråga om fenotypiska och molekylära egenskaper. Metoder för isolering kan resultera i en homogen cellpopulation.

AFSCs eller AMSCs kan användas som verktyg inom regenerativ medicin: upprättande av odlingsförhållanden med minimala eller inga animaliska substanser.

Marker Discovery
AfSCs och AMSCs initiala karakterisering kan utföras med hjälp av immunofenotypanalys med hjälp av välkaraktäriserade cellytemarkerare, till exempel AFSCs: CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58, CD44, HLA-ABC, SSEA-4: CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, Sox2, Tra1-60, Tra1-80, FGF-4, CFC-1 och PROM1.

Transkriptomik och proteomik visade på identifiering av viktiga markörer som uttrycks som
AFSCs: Nanog, Sox2, POU5F1, NF2, IGF2, PLAU, OXTR, HHAT, RCS5, CDC2, COL2, TAGLN, Gsn, Anx4, GSTP, CK-19, Vim, Col1 och Gal: OGN, βIG-H3 och CD49F.
Då det inte finns någon gemensam markör tillgänglig för AFSC och AMSC, måste en bredare panel av markörer användas. Detta uppmanar också till att genomföra ytterligare detaljerade array- och funktionsanalyser för att definiera de lämpligaste markörerna för karakterisering av AFSC och AMSC.

Interessentkonflikter

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.