Frontiers in Oncology

Introduktion

Det är känt att ihållande infektion med humant papillomvirus med hög risk (hr-HPV) är en nödvändig orsak till livmoderhalscancer och precancerösa lesioner (1, 2). Med en avslöjad etiologi är livmoderhalscancer i hög grad möjlig att förebygga (3, 4). Utvecklade länder har börjat använda hr-HPV-testning vid primär screening av livmoderhalscancer, antingen ensamt eller tillsammans med cytologi (5-8). Det finns bevis för att HPV-baserade screeningprogram ger ett bättre skydd mot precancer och cancer i livmoderhalsen än andra traditionella screeningmetoder, t.ex. cytologi (9-11). Eftersom de flesta HPV-infektioner kan rensas bort spontant identifierar HPV-testning emellertid många infektioner som inte kommer att utvecklas till livmoderhalsförcancer eller livmoderhalscancer, särskilt hos unga kvinnor (12). Därför rekommenderas inte HPV-dna-testning för screening av kvinnor under 30 år. Dessutom kan HPV-positiva patienter som hänvisas till efterföljande ingrepp drabbas av onödiga invasiva ingrepp.

I Kina fanns det 98 900 nya fall och 30 500 dödsfall av livmoderhalscancer 2015 (13). För att stävja den ökande trenden av denna malignitet har den kinesiska regeringen tillhandahållit ett landsomfattande gratis screeningprogram för livmoderhalscancer för kvinnor som bor på landsbygden sedan 2009, med hjälp av VIA/VILI, Papanicolaou (Pap)-test eller HPV-test (i pilotområden), baserat på ekonomisk och teknisk utvecklingsnivå (14). På grund av dessa screeningmetoders karaktär måste dock den diagnostiska noggrannheten förbättras. Med tanke på Kinas stora befolkning bör man dessutom utvärdera nya screeningverktyg med en balans mellan känslighet och specificitet.

Diesesspecifika molekylära markörer för livmoderhalscancer ger en kombination av hög känslighet och hög specificitet för att upptäcka pre-cancer i livmoderhalsen. De flesta av dessa markörer identifierades utifrån mekanismen för HPV-relaterad karcinogenes. HPV RNA-testningen bygger på detektion av HR-HPV E6 och E7 mRNA. HPV-infektionens onkogena potential beror på produktionen av virala E6/E7-onkoproteiner. Således ger detektion av E6/E7 mRNA-transkriptioner möjlighet till ett specifikt test för att upptäcka precancerösa lesioner.

I den här studien utvärderade vi den kliniska prestandan hos HPV E6/E7 mRNA-testet för att upptäcka höggradig cervikal intraepitelial neoplasi (CIN) och cancer bland kinesiska kvinnor.

Material och metoder

Deltagare och förfaranden

Denna sjukhusbaserade studie genomfördes under april till december 2017 i Henanprovinsen, Kina. Kvinnor som besökte gynekologiavdelningen vid The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University (SAHZU) för kolposkopi bjöds in. Inklusionskriterierna var följande: (1) kvinnor i åldern 25-64 år; (2) ingen historia av livmoderhalscancer eller hysterektomi; (3) inga kliniska symtom på graviditet eller 8 veckor efter avslutad graviditet; och (4) förstår studieprocedurerna och deltog frivilligt. Studien godkändes av Institutional Review Board (IRB) vid Henan Cancer Hospital (HCH). Skriftligt informerat samtycke erhölls från varje deltagare.

De cervikala exfolierade cellerna erhölls från kvinnor under den gynekologiska undersökningen. Provet konserverades i 20 ml PreservCyt® transportmedium (Hologic Inc., Marlborough, MA, USA) och förvarades vid 4 °C. Därefter utfördes en kolposkopisk undersökning av en gynekolog. Kvinnor med onormala kolposkopifynd genomgick en biopsi med riktade skador. Om kolposkopiundersökningen var otillfredsställande (squamocolumnar-övergången var inte helt synlig) utfördes endocervikal curettage (ECC). Prover av exfolierade celler från livmoderhalsen transporterades till Cancer Institute and Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (CICAMS). Proverna delades upp i två delar: 1,5 ml cellblandning i ett EP-rör för HR-HPV-DNA-test och HPV E6/E7 mRNA-test. Den kvarvarande konserveringen med exfolierade celler användes för ThinPrep cytologiskt test (TCT) (Hologic Inc., Marlborough, MA, USA). Bethesda-rapporteringssystemet användes för cytologi av en senior cytolog (15).

HR-HPV DNA-analys

De 400 μl cellblandningsproverna från 1,5 ml EP-rör användes för att detektera DNA av 14 hr-HPV-typer (16, 18, 31, 33, 33, 35, 39, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 och 68) med Cobas 4800 HPV-analysen (Roche, Basel, SUI). Det rapporterade det sammanlagda resultatet av de 14 HPV-typerna och det separata resultatet för HPV 16 och 18 samtidigt (16). Cobas 4800 var ett PCR-baserat test för HPV-DNA med nukleinsyrahybridiseringsamplifiering enligt tillverkarens anvisningar. Negativa och positiva kvalitetskontroller fastställdes i varje test. Om ct-värdet var större än 40 ansågs resultatet vara negativt. I annat fall var resultatet positivt. De positiva resultaten omfattade tre typer: HPV 16, HPV 18 och HPV övriga (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 och 68).

HPV E6/E7 mRNA-testning

Ett ml-prov från 1,5 ml EP-rör användes för att detektera det virala mRNAet E6/E7 från HPV-typerna från 14 timmars HPV i det samlade APTIMA HPV-testet (Hologic Inc, Marlborough, MA, USA), enligt tillverkarens anvisningar (17). Det var ett test i tre steg, inklusive mRNA-extraktion, amplifiering och detektion av den amplifierade produkten. Om kopieringsantalet var större än eller lika med 1,0 ansågs resultatet vara positivt. I annat fall var resultatet negativt.

Histopatologisk diagnos

Biopsi- och ECC-vävnader skickades till SAHZU för histopatologiska diagnoser enligt rapporteringssystemet för cervikal intraepitelial neoplasi (CIN). Därefter granskade histopatologer från HCH alla objektglas. Eventuella inkonsekventa patologiska diagnoser skickades till CICAMS för bedömning. Den slutliga diagnosen för varje kvinna baserades på den sämsta avläsningen från panelgranskningen. All upptäckts- och diagnostiseringsprocess var blind.

Statistisk analys

Den slutliga histopatologiska diagnosen användes som guldstandard. Kvinnor med TCT-diagnosen låggradig squamös intraepitelial lesion (LSIL) eller sämre (LSIL +) betraktades som vätskebaserad cytologi (LBC) positiv. HPV-DNA-resultaten stratifierades enligt HPV-typerna: HPV16/18 (dvs. HPV16 och/eller HPV18 positiva), HPV-andra (dvs. någon av de 12 hr-HPV-typerna positiva utom HPV16 och HPV18) och HPV-totalt (dvs. någon av de 14 hr-HPV-typerna positiva). Absoluta skattningar och 95 % konfidentiella intervaller (95 %CI) för positivfrekvens, sensitivitet, specificitet, positivt prediktivt värde (PPV) och negativt prediktivt värde (NPV) beräknades. Skillnaderna i HPV mRNA-uttryck i olika HPV-grupper beräknades med hjälp av chi-två-testet eller Fishers exakta test. McNemar-testet användes för att identifiera skillnaderna i känslighet och specificitet. α-nivån sattes till 0,05, och p < 0,05 (tvåstorlek) ansågs vara statistiskt signifikant.

Resultat

Totalt ingick 537 kvinnor i denna analys. Medelåldern var 43,88 ± 10,97 år. LBC-diagnoserna var: 183 (34,7 %) normala, 135 (25,1 %) atypiska skivepitelceller av obestämd betydelse (ASC-US), 22 (4,1 %) atypiska skivepitelceller kan inte utesluta HSIL (ASC-H), 7 (1.3 %) atypisk körtelcell (AGC), 82 (15,3 %) LSIL, 75 (14,0 %) höggradig skivepitelcelllesion (HSIL), 31 (5,8 %) skivepitelcellkarcinom (SCC) och 2 (0,4 %) adenokarcinom in situ (AIS). De histopatologiska diagnoserna var 298 (55,5 %) normala, 30 (5,6 %) cervikal intraepitelial neoplasi grad 1 (CIN1), 48 (8,9 %) CIN2, 111 (20,7 %) CIN3, 43 (8,0 %) SCC och 7 (1,3 %) AIS.

Tabell 1 visade korrelationen mellan mRNA- och DNA-detektion av HPV-typer. Den totala överensstämmelsen mellan de två testerna var 90,7 % (95 % KI: 87,9, 92,9) med ett kappavärde på 0,81. Den positiva andelen mRNA var 91,7 %, 84,6 % och 86,4 % hos HPV16/18-, HPV-andra- och HPV-totalt-positiva kvinnor. Alla positiva mRNA-frekvenser var högre hos HPV-positiva kvinnor än HPV-negativa kvinnor i samma HPV-typgrupp (alla p < 0,001).

De positiva HPV DNA-, mRNA- och LBC-frekvenserna ökade med svårighetsgraden av den histopatologiska diagnosen och varierade från 25,5, 19,1 och 11,4 % i normala fall till 100,0 % i SCC, respektive. De positiva frekvenserna för de tre testerna i AIS var 85,7, 85,7 respektive 100,0 %. De tre testerna hade liknande positiva resultat för CIN3, SCC och AIS. Men de positiva frekvenserna för mRNA var relativt lägre hos kvinnor med diagnosen CIN2. De positiva andelarna för HPV16 var högst i CIN3, SCC och AIS jämfört med andra HPV-DNA-grupper. HPV18-positiva andelar var lägre än 7 % i alla skivepitelförändringar, men något högre (28,6 %) i AIS (tabell 2).

Tabell 3 visade den kliniska prestandan hos de tre testerna när det gäller att upptäcka CIN2+ och CIN3+ lesioner. Känsligheten för mRNA för att upptäcka CIN2+ och CIN3+ var 93,8 % (95 %CI: 89,7-96,4) respektive 95,7 % (95 %CI: 91,3-97,9), vilket inte skiljde sig från de som upptäcktes med DNA (95,7 % för CIN2+, 96,3 % för CIN3+), men var högre än de som upptäcktes med LBC (80,4 % för CIN2+ och 88,8 % för CIN3+). Specificiteten för mRNA för att upptäcka CIN2+ (79,0 % ) och CIN3+ (70,5 % ) var betydligt högre än de som upptäcktes med DNA (71,0 % för CIN2+, 62,8 % för CIN3+) (p < 0,05), men lägre än de som upptäcktes med LBC (84,5 % för CIN2+, 79,8 % för CIN3+). PPV för mRNA för att upptäcka CIN2+ och CIN3+ var 74,0 % (95 %CI: 68,4-78,9) och 58,1 % (95 %CI: 52,1-63,9), och NPV var 95,2 % (95 %CI: 92,0-97,2) respektive 97,4 % (95 %CI: 94,8-98,8).

Tabellerna 4, 5 visade de positiva frekvenserna och den kliniska prestandan för de tre testerna i olika åldersgrupper. Sammanfattningsvis visade alla tester bättre resultat för kvinnor äldre än 30 år än för yngre kvinnor. HPV DNA-testet hade den högsta känsligheten och LBC hade den högsta specificiteten för att upptäcka CIN2+ och CIN3+ hos kvinnor yngre än 30 år.

Diskussion

De presenterade resultaten visade att mRNA-testet och DNA-spenen uppnådde en hög samstämmighet på 90,7 %. HPV DNA-, mRNA- och LBC-positivfrekvenserna ökade med svårighetsgraden av histopatologidiagnosen, från 25,5, 19,1 och 11,4 % i normalfallet till 100,0 % i SCC, respektive. Känsligheten för mRNA för att upptäcka CIN2 och CIN3+ var 93,8 % och 95,7 %, vilket liknade de som upptäcktes med DNA (95,7 % för CIN2+ och 96,3 % för CIN3+). Men specificiteten för mRNA (79,0 % för CIN2+ och 70,5 % för CIN3+) var betydligt högre än de som upptäcktes med DNA (71,0 % för CIN2+ och 62,8 % för CIN3+).

I den här studien uppvisade HPV E6/E7 mRNA-testet och HPV DNA-testet hög överensstämmelse. Av de HPV 16/18 DNA-positiva kvinnorna var 91,7 % också positiva på mRNA, vilket liknar andra studier som rapporterat en övergripande överensstämmelse på över 90 % mellan APTIMA HPV-testet och HPV DNA-testet (17, 18) och genomgående högre positivfrekvens för HPV DNA-testet i olika populationer (19, 20). Vi noterade högre positiva frekvenser hos äldre kvinnor än hos yngre kvinnor, vilket skiljer sig något från andra studier (21-23). Denna variation kan tillskrivas studiens utformning (dvs. sjukhusbaserad studie), vilket begränsar extrapoleringen av resultaten till den allmänna befolkningen. Intressant nog var diskordansgraden högre hos kvinnor som var 30 år eller yngre (25,6 % jämfört med 8,6 %). Studier har visat på en högre frekvens av spontan clearance för HPV-infektion hos yngre kvinnor, vilket tyder på en lägre möjlighet till HPV-integration (24).

Som bekant upptäcker DNA-baserade HPV-test förekomst eller frånvaro av HPV-DNA. De flesta HPV-infektioner är dock övergående och försvinner spontant inom ett år, vilket inte skulle utvecklas till livmoderhalsförcancer eller cancer (25). E6/E7 mRNA-uttryck förekommer endast i aktivt infekterade celler och ökar under utveckling och progression av CIN (26). HPV mRNA-testet antas därför vara mer specifikt när det gäller att upptäcka höggradiga cervikala lesioner. Våra uppgifter bekräftade denna hypotes. Vi fann att mRNA-testet var lika känsligt som DNA-testet, men mer specifikt när det gäller att upptäcka pre-cancer och cancer i livmoderhalsen. Andra forskare drog liknande slutsatser antingen vid primär screening (20) eller vid triage av kvinnor med mindre avvikande cytologi (27). I vår studie hade 50 kvinnor diskordanta resultat mellan HPV DNA- och mRNA-test. Bland dem diagnostiserades 34 DNA + /mRNA- jämfört med 8 mRNA + /DNA- som normala eller CIN1; 6 jämfört med 2 diagnostiserades som CIN2 eller CIN3; ingen testskillnad observerades i cancer. Om vi ersätter HPV DNA-testet med mRNA-testet skulle därför 34 kvinnor inte hänvisas till onödig kolposkopi, men 4 CIN2 och 2 CIN3 skulle missas. Trots att 6 fall saknades förlorades ingen känslighet, men specificiteten ökade. Litteraturen visade att 40-60 % av CIN2-fallen skulle regrediera inom 2 år (28, 29), och inte alla CIN3-fall var verkliga precancerösa lesioner (30). Cook et al. fann också en låg CIN2+-frekvens bland mRNA-/DNA+-kvinnor (17). Därför var risken för invasiv cancer för de 6 kvinnorna låg under ett kort tidsintervall.

Vi utvärderade också testets prestanda hos äldre och yngre kvinnor. Den åldersspecifika analysen visade att de tre testerna fungerade bättre hos kvinnor äldre än 30 år. Baserat på det faktum att yngre kvinnor med CIN-lesioner hade en högre möjlighet till regression föreslår vi en konservativ hantering av yngre kvinnor. Studier har visat att HPV-infektioner var vanliga hos unga kvinnor, men en stor del av dem var övergående infektioner och kan rensas bort spontant (31, 32). Den korta varaktigheten hos de flesta HPV-infektioner hos dessa kvinnor tyder på att den associerade livmoderhalsdysplasin bör hanteras konservativt (12). Därför är HPV-DNA-testet kanske inte en lämplig screeningmetod för kvinnor under 30 år på grund av den höga falskt positiva frekvensen. Screeningprestanda för cytologi och E6/E7 mRNA omfattande hos unga kvinnor bör utvärderas. I vår studie visade data att cytologi hade den högsta specificiteten hos kvinnor under 30 år, men känsligheten är lägre än HPV-DNA-testet. När det gäller E6/E7 mRNA hade det dock en måttlig prestanda hos kvinnor yngre än 30 år, som hade högre känslighet än cytologi tillsammans med högre specificitet än HPV-DNA, vilket tyder på att testning av E6/E7 mRNA kan vara ett lovande alternativ för screening av kvinnor under 30 år.

Trots att Kinas livsmedels- och läkemedelsmyndighet godkände tre profylaktiska HPV-vacciner (dvs. Cervarix, Gardasil och Cecolin), bygger förebyggande av livmoderhalscancer fortfarande på screening. År 2009 lanserade den kinesiska regeringen en landsomfattande gratis screening av livmoderhalscancer för kvinnor på landsbygden. År 2015 användes HPV-DNA-testet för första gången som ett primärt screeningverktyg på pilotområden. På grund av den stora befolkningen skulle dock HPV-DNA-baserad screening resultera i oundvikliga enorma falska positiva resultat, vilket skulle leda till slöseri med sjukvårdsresurser och onödig oro. Det är lovande att mRNA skulle kunna användas i det nationella screeningprogrammet för livmoderhalscancer för att minska antalet falskt positiva utan att förlora någon känslighet.

Vissa begränsningar bör tas upp i denna studie. För det första är detta en tvärsnittsstudie och vi kunde inte utvärdera risken för lesionsprogression i samband med HPV E6/E7 mRNA. Vi stratifierade dock våra data efter histologisk grad, vilket ger information om korrelationen. För det andra är det viktigt att notera att resultaten inte kan generaliseras fullt ut till den allmänna befolkningen eftersom studiedeltagarna rekryterades från öppenvården på sjukhus.

Slutsatsen är att APTIMA mRNA-testet hade god överensstämmelse med Cobas 4800 HPV DNA-testet med liknande sensitivitet och högre specificitet för att upptäcka höggradiga livmoderhalsskador. Det är lovande att mRNA skulle kunna användas i Kinas nationella screeningprogram för livmoderhalscancer för att minska falskt positiva utan att förlora känslighet. Ytterligare studier behövs för att utvärdera den kliniska prestandan hos mRNA-testet hos yngre kvinnor i Kina.

Data Availability Statement

Alla dataset som genererats för den här studien ingår i artikeln/tilläggsmaterialet.

Ethics Statement

Studierna som involverar mänskliga deltagare granskades och godkändes av roll av samuttryck av HPV E6/E7 mRNA och p16/Ki-67-protein för att förutsäga risken för livmoderhalscancer. Av Life Science Ethics Review Committee of Zhengzhou University. Patienterna/deltagarna gav sitt skriftliga informerade samtycke till att delta i denna studie.

Författarnas bidrag

S-KZ bidrog till utformningen och skrev manuskriptet. ZG bidrog till manuskriptets skrivande och revidering. PW, M-MJ och P-PG bidrog till utredningen och HPV-DNA-testet. L-NK och Z-NW bidrog till HPV mRNA-testet. D-MZ bidrog till cytologisk och histologisk undersökning. QC och X-QC utförde den statistiska analysen. X-BS bidrog till att utforma studien och hjälpte till med de statistiska analyserna. Y-LQ och J-GZ hjälpte till att utforma studien och hjälpte till med att skriva manuskriptet. J-GZ hjälpte till med genomförandet av studien. Alla författare läste och godkände det slutliga manuskriptet.

Finansiering

Detta arbete stöddes av Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (Grant No. 81502475) och Science and Technology Project of Henan Province (Grant No. 172102310067).

Intressekonflikt

Författarna förklarar att forskningen utfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Acknowledgments

Alla kvinnor som medverkade i den här studien tackas för sitt deltagande. Vi uppskattar också bidraget från alla relevanta läkare för den här studien och hjälpen från National Cancer Center, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences och Peking Union Medical College. Vi uppskattade också 32nd International Papillomavirus Conference (IPVC 2018) för att tillhandahålla en plattform för att presentera abstraktet av studien (titel: Klinisk prestanda för HPV E6/E7 mRNA-test för att upptäcka cervikal höggradig intraepitelial neoplasi och cancer: A Hospital-based Study in China, IPVC8-0744 Poster Session).

Abkortningar

hr-HPV, humant papillomvirus med hög risk; VIA/VILI, visuell inspektion med ättiksyra/visuell inspektion med Lugols jodlösning; Pap, papanicolaou; SAHZU, Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University; IRB, Institutional Review Board; HCH, Henan Cancer Hospital; CICAMS, Cancer Institute and Hospital Chinese Academy of Medical Sciences; 95 %CI, 95 % konfidentiella intervall; ECC, endocervikal curettage; TCT, ThinPrep cytologiskt test; CIN, cervical intraepithelial neoplasia; LSIL, low-grade squamous intraepithelial lesion; HSIL, high-grade squamous intraepithelial lesion; LBC, liquid-based cytology; PPV, positivt prediktivt värde; NPV, negativt prediktivt värde; ASC-US, atypiska skivepitelceller av obestämd betydelse; ASC-H, atypiska skivepitelceller som inte kan utesluta HSIL; AGC, atypisk körtelcell; SCC, skivepitelkarcinom; AIS, adenokarcinom in situ.

.