Differentiella effekter på membranpermeabilitet och livsduglighet hos mänskliga keratinocytceller som utsätts för megasonfält med mycket låg intensitet

Effekten av exponering för mycket lågintensiva amerikanska strålningssystem (Ispta mellan 7 och 16 mW/cm2, långt under kavitationströskeln, 100 mW/cm2) med en frekvens på 1 MHz har studerats på HaCaT-celler. Experimenten utfördes med en likvärdig medicinsk installation som skisseras i figur S1 i ESI, med varierande behandlingsparametrar, t.ex. Ispta, arbetscykel och sonikationstid. Preliminära experiment visade att temperaturen förblev konstant (inom 1 °C) inom det intervall av exponeringsparametrar som här behandlas, med undantag för den termiska dissipationen av den amerikanska energin. Behandlingarna visade inte heller att de studerade effekterna var signifikant beroende av US-vågens arbetscykel. Dessa observationer stämmer överens med den låga US-absorptionen vid 1 MHz; tvärtom kan termiska effekter och arbetscykel påverka celler och vävnader som exponeras för högre frekvenser, eftersom US-dämpningskoefficienten är proportionell mot frekvensen23,31.

Resultaten kommer inledningsvis att presenteras med hänsyn tagen till de två relevanta exponeringsparametrarna, sonikationstid och Ispta, separat. De strukturella och fysiska förändringarna av cellmembranet (permeabilitet, upptagseffektivitet och maximal storlek på de internaliserade molekylerna) kommer att analyseras och korreleras till motsvarande cytotoxiska skador och till eventuell aktivering av inflammatoriska mönster. Därefter kommer resultaten att tolkas i termer av soniceringsdosen, definierad som produkten av Ispta och exponeringstiden, dvs. yttätheten av den akustiska energi som infaller på provet under soniceringen. Egentligen är de studerade fenomenen beroende av denna kvantitet och detta gjorde det möjligt för oss att identifiera ett intervall av exponeringsparametrar där en övergående SP inträffar med försumbara biologiska skador.

Analys av inflytandet av US-exponeringstiden

Förändringar i membranpermeabiliteten hos HaCaT-celler som induceras av lågintensiv 1 MHz US uppskattades i termer av upptagseffektiviteten för den gröna fluorescerande sonden calcein. Eftersom intakta membran är ogenomträngliga för calcein är det en tillförlitlig markör för SP. Procentandelen grönpositiva celler kvantifierades genom flödescytometrianalyser enligt avsnitt 2.5.

För att utvärdera membranpermeabilitetens känslighet för US-exponeringstiden användes en mycket låg US Ispta. Det är anmärkningsvärt att redan en Ispta på 7 ± 1 mW/cm2 kan utlösa betydande effekter på membranpermeabiliteten vid lämplig exponeringstid. Representativa resultat av parallella flödescytometriundersökningar av HaCaT- och NIH-3T3-celler som båda sonicerats vid Ispta ~7 mW/cm2 i 5′, 15′, 30′ och 45′ visas i figur 1 (röda trianglar respektive blå kvadrater). Som väntat resulterar jämförelsen mellan cellinjerna efter låga sonikationstider (under tröskelvärdet för sonoporation) i en liten affinitet för calcein, där skillnaderna (de högsta i HaCaT-cellerna) bör bero på deras respektive membransammansättning och permeabilitetsegenskaper. Viktigare är att båda cellinjerna visar en signifikant ökning av upptagseffektiviteten från 15′ exponering, vilket motsvarar en soniceringsdos på (6,3 ± 0,9) J/cm2 , vilket tyder på att SP-processen aktiveras. Enligt de bästa anpassningarna i figur 1, för längre exponeringstider, visar våra experiment på ett linjärt samband mellan upptagseffektivitet och exponeringstid, med en identisk upptagshastighet som induceras av US i både HaCaT- och NIH-3T3-celler (linjära regressionssluttningar (%/min) 1,3 ± 0,2 och 1,4 ± 0,2 för HaCaT respektive NIH-3T3). Detta skulle betyda att ökningen av upptagseffektiviteten på grund av SP är ett cellinjeoberoende fenomen.

För att ytterligare undersöka SP-processen och karaktärisera internaliseringen utvärderades behandlade HaCaT-celler med fluorescensmikroskopi. I överensstämmelse med flödescytometriresultaten visar prover som sonicerats i 5′ ingen signifikant förändring av membranpermeabiliteten med avseende på kontrollprovet (obehandlat), medan man från 15′ observerar en ökande upptagseffektivitet (se fig. 2 och fig. S2 i ESI), även om inte alla celler visade fluorescens. På motsvarande sätt verkar cellerna vara mindre täta och vidhäftande jämfört med kontrollprovet, vilket tyder på en uppluckring av de täta förbindelserna. De representativa bilderna i fig. 2 tyder på en heterogen lokalisering av calcein i cellerna, och i själva verket gjorde konfokal fluorescensmikroskopi det möjligt att tydligt skilja den perifera fördelningen av sonden från den interna fördelningen i HaCaT-cellerna (se bild och 3D-rekonstruktioner i fig. 3). Ytterligare detaljerade bilder visas i avsnitt 3 i ESI. Observationerna stämmer överens med ett upptag av fluorsonden på två nivåer: en perifer nivå, där sonden är lokaliserad i det endoplasmatiska retikulumnätverket runt plasmamembranet, och en annan nivå, som uppvisas tydligt efter 30′ exponering, där sondens diffusion till cytoplasman orsakar en intensiv fluorescens som är jämnt fördelad över hela cellen, inklusive nukleoplasman. Det bör noteras att Stokes-diametern för calcein är ~1,36 nm och att dess transport inom kärnan inte hindras av diffusionsbarriärer29. En mer fullständig analys som redovisas i avsnitten 3.2 och 3.3 gör det möjligt att dra slutsatsen att US-exponeringsdosen och sondens molekylvikt var dominerande faktorer för upptaget.

En annan analys baserad på den röda PI-fluoresubstans utfördes för att utvärdera återhämtningen av den ursprungliga membranpermeabiliteten hos sonicerade celler (se även avsnitt 2.3). Internalisering av PI betecknar aktivering av cytotoxiska processer. Samlokalisering av de gröna och röda färgämnena inne i cellerna indikerar därför att membranåterhämtningsprocessen efter SP misslyckats. Å andra sidan pekar observationen i cellerna av den gröna fluorescensen i avsaknad av den röda på förekomsten av SP i membranen under den amerikanska behandlingen och dess framgångsrika återhämtning efter det att fältet stängts av. Representativa konfokala fluorescensbilder visas i figur 4. Samlokaliseringen av de två färgämnena saknas i de celler som behandlats under 15′, medan den knappt observeras efter 30′ exponering (figur S5 i ESI). Konsekvent avslöjades en nettoförlust av livsduglighet på ~5 %, vilket kontrollerades med flödescytometri. I cellerna som sonicerats under 45′, vilket motsvarar en dos på (19 ± 3) J/cm2, är samlokaliseringen tydligare (se vita pilar i fig. 4B) och en mer betydande förlust av livsduglighet inträffar (~10 %, kontrollerad med flödescytometri). Dessa resultat tyder på att en längre exponeringstid, som motsvarar en högre dos vid fast Ispta, inducerar en irreversibel förändring av membranstrukturen följt av en följdriktig cytotoxisk reaktion.

Analys av påverkan av US-intensitet

Effekten av att variera intensiteten av det applicerade US-fältet på membranpermeabiliteten analyserades på HaCaT-cellinjen efter 15′ exponering, tillräckligt kort för att utesluta effekter inducerade av en långvarig sonikation. I vår studie låg intensiteten i intervallet mellan Ispta = (7 ± 1) mW/cm2 och Ispta = (16 ± 1) mW/cm2, långt under kavitationströskeln24. I enlighet med det protokoll som beskrivs i avsnitten 2.3 och 2.5 användes FITC-märkta dextrans med olika MW (MW = 10, 40 och 70 kDa) för att för varje US-intensitet karakterisera induktionen av membranpermeabilitet för de olika molekylstorlekarna. Detta förfarande gör det i sin tur möjligt att utvärdera sonoporernas storlek. I likhet med calcein kommer dextrans inte in i de obehandlade cellerna på ett betydande sätt31,32 , medan cellupptaget av FITC-märkta dextrans i kavitations-US-regimen kan ökas kraftigt både genom SP och genom främjande av endosomtrafiken30. I detta avseende visar resultaten av flödescytometriska mätningar som redovisas i fig. 5 tydligt ett storleksberoende upptag, ett fenomen som gör det möjligt för oss att utesluta samtidiga aktiva endocytoseffekter och som enligt litteraturen22 tyder på att SP som utlöses av låg intensitet är den huvudsakliga mekanismen som är inblandad i transporten av dextranmolekyler genom plasmamembranet. Det observerade SP-inducerade upptaget kännetecknas av ett tröskelvärde Ispta, som ökar linjärt med ökningen av MW för de internaliserade molekylerna. Under detta tröskelvärde är upptagseffektiviteten hos behandlade celler jämförbar med den hos oexponerade celler. Tröskelvärdena för Ispta redovisas i tabell 1. För intensiteter över tröskelvärdet ökar upptagseffektiviteten med ökningen av Ispta tills ett maximum uppnås. För 10 kDa dextran minskar den sedan något till en platå. Den observerade minskningen av upptagseffektiviteten vid höga intensiteter kan förklaras av det ökade antalet döda celler, som avlägsnas från provet vid sköljning och därmed inte bidrar till flödescytometrianalyserna. Dessutom kan aktiveringen av apoptotiska processer hindra internaliseringen av färgämnet. Det är värt att notera att för Ispta = 15 mW/cm2 , även om detta värde är mycket lägre än kavitationströskeln, kan cellerna internalisera 70 kDa dextrans, med en Stokesdiameter på ~12 nm. Detta värde kan ses som en uppskattning av den minsta storleken på de sonoporer som bildas i membranet. I figur S6 (avsnitt 4 i ESI) redovisas en uppsättning representativa fluorescensbilder som visar dextransupptaget vid tröskelvärdet Ispta tillsammans med PI-testet.

Internaliseringen av PI pekar ut ett signifikant cytotoxiskt svar vid Ispta = 15 mW/cm2 (exponeringsdos 13,5 J/cm2). Som rapporterats av Udroiu et al.13 under liknande experimentella förhållanden observerades också en liten men signifikant ökning av förekomsten av mikrokärnor i NIH-3T3-celler, beroende på intensitet och exponeringstid för 1 MHz US. Dessa observationer tydde på att det krävdes ytterligare studier för att bättre förstå de bioeffekter som åtföljer membran-SP, och därför genomfördes en studie av den biologiska responsen hos sonicerade celler som en funktion av US-intensiteten.

Den biologiska responsen på SP-inducerade ”membransår” som inducerades av mycket låga US-intensiteter karakteriserades noggrant genom att utvärdera celldöd med hjälp av den kombinerade AnnexinV- och PI-analysen som beskrivs i avsnitt 2.5 (se även avsnitt 5 i ESI). Vi utvärderade också uttrycket av genen IL-6, en cytokin som kopplar kronisk inflammation till cancer33,34. Resultaten från flödescytometrianalysen, uttryckta i form av cellprocent, redovisas i figur 6. Cellviabiliteten bevaras huvudsakligen (>90 %) under 15′-behandlingar, men från och med Ispta = 9 mW/cm2 sker en liten minskning som åtföljs av en ökning av de tidiga apoptotiska cellerna. Vid Ispta = 14 mW/cm2 börjar en betydande andel nekrotiska celler att observeras, medan vid Ispta = 16 mW/cm2 även sen apoptos bidrar till celldöden, i motsats till en liten minskning av nekrosen (representativa flödescytometriska prickdiagram i figur S7 i ESI). IL-6-genuttrycket bestämdes genom RT-PCR (fig. 7). Ingen uppreglering observerades för Ispta ≤15 mW/cm2 medan behandlingen vid 16 mW/cm2 inducerade en överexpression av denna gen jämfört med obehandlade celler.

Dessa resultat tyder på att, med utgångspunkt från ett Ispta-tröskelvärde på 16 mW/cm2 och 15′ sonikation, minskar de membranskador som orsakas av US inte bara cellernas livsduglighet, utan kan också, genom överuttryck av den inflammationsrelaterade genen IL-6, framkalla ett inflammatoriskt svar. Eftersom flera undersökningar har visat att inflammation spelar en roll när det gäller att främja patogenesen och utvecklingen av sjukdomar som cancer35,36, behövs ytterligare undersökningar för att bättre karaktärisera de aspekter som är relaterade till inflammatoriska mönster.

Analys av soniceringsdosens inverkan

För att kvantitativt analysera förhållandet mellan det applicerade US-fältet och de observerade biologiska effekterna i termer av den energi som levereras till cellerna under exponeringen, beräknades soniceringsdosen för varje behandling som produkten av intensiteten Ispta med exponeringstiden. De erhållna värdena redovisas i tabell 2, där de observerade biologiska effekterna identifieras med bakgrundsfärger. Våra resultat tyder på att membran-SP inträffar från och med en tröskeldos på cirka 6,3 J/cm2. Dessutom kan sonoporernas storlek relateras till soniceringsdosen. För doser högre än 10,8 J/cm2 observeras en minskning av livsdugligheten och samtidig tidig apoptos i den behandlade cellen, följt av sen apoptos, nekros och överexpression av IL-6 från och med 14,4 J/cm2.

Vi vill betona att denna dos, och Ispta 16 mW/cm2, motsvarar ett negativt topptryck på ~0,02 MPa. Detta värde verkar tillräckligt högt för att inducera mekanisk stress vid gränssnittet mellan plasmamembran och vatten, även om det faller en storleksordning lägre än det tröskelvärde för säkerhetsexponering som hittills föreslagits (mekaniskt index ~0,2-0,3, vid 1 MHz).

Vissa om att våra experiment jämfördes med framgång med de experiment som utfördes med hjälp av ett elektromedicinskt system som faktiskt används vid amerikansk terapi (se även avsnitt 2.2), vilket understryker den medicinska relevansen av vår metod. I detta avseende är vi övertygade om att tillhandahållandet av information om soniceringsdosen (vid den fasta US-frekvensen) gör det möjligt att få ett mer fullständigt index för karakterisering av cellens reaktion på US-exponering och, i sin tur, en noggrann identifiering av en rad parametrar där övergående SP förekommer med försumbara biologiska skador.

Ett mycket viktigt steg för att förstå den biologiska effekten in vivo av våra resultat skulle vara att driva US-exponeringar på tredimensionella biosystem, såsom mänskliga vävnader som består av flerstaplade cheratinocyter eller av endotelceller i blod-hjärnbarriären.