Bookshelf

Många av de enzymer som är involverade i peptidbiogenesen har identifierats

De vanligaste stegen i prekursorbehandlingen och de enzymer som är involverade visas i figur 18-5. De inblandade endoproteaserna är prohormonkonvertaserna 1 och 2 (PC1 och PC2), exopeptidaset är karboxypeptidas E (CPE, även kallat CPH och enkefalinkonvertas) och det α-ammiderande enzymet är peptidylglycin α-ammiderande monooxygenas (PAM). Många steg i biosyntesen är inte unika för neuropeptider, t.ex. signalpeptidklyvning, bildande av disulfidbindningar, tillsats och efterföljande modifiering av N-länkade och O-länkade oligosackarider, fosforylering och sulfatering. Som diagrammet i figur 18-3 visar inträffar många av de posttranslationella stegen när de mognande neuropeptiderna färdas längs axonet mot synapsen i LDCV:er. De senare stegen i neuropeptidbiosyntesen (figur 18-5) är unika för neuroner och endokrina celler.

Nyckelenzymer i neuropeptidbiosyntesen inkluderar endoproteaser, exoproteaser och enzymer som modifierar peptidernas ändar. Upptäckten och karakteriseringen av Kex2p, endoproteaset som klyver jästens pro-α-parningsfaktor för att producera fyra kopior av feromonet α-parningsfaktor (fig. 18-2), var avgörande för upptäckten av däggdjurs prohormonkonvertaserna, inklusive furin, PC1/3, PC2, PC4, PC5/6, PC7/8/LPC och PACE4 . Prohormonkonvertaserna delar homologi med bakteriella subtilisins och har en katalytisk Asp-His-Ser-triad, som består av tre viktiga aminosyror som är involverade i katalysen (betecknade D, H och S i figur 18-5). Proregionen för var och en av dem (fig. 18-5) måste vara närvarande under biosyntesen för att proteaset ska kunna veckas korrekt, men måste avlägsnas för att ge ett aktiverat proteas. För PC1 och furin sker avlägsnandet av proregionen inom några minuter efter biosyntesen medan enzymet befinner sig i det endoplasmatiska retikulumet och är sannolikt en autokatalytisk händelse. För de andra prohormonkonvertaserna sker avlägsnandet av proregionen mycket långsammare. Uttryck av aktiv PC2 kräver samexpression av peptiden 7B2 (fig. 18-5), som verkar ha en chaperonfunktion och som också kan förhindra uttryck av PC2:s endoproteolytiska aktivitet tills PC2 har deponerats i sekretoriska granuler. Ingen motsvarande chaperon/inhibitorpeptid har identifierats för de andra prohormonkonvertaserna.

De däggdjursendoproteaser som tydligast är involverade i neuropeptidbearbetning är PC1 och PC2, Ca2+-beroende proteaser som finns i sekretoriska granuler och vars uttryck är begränsat till neuronerna och endokrina celler (Fig. 18-5). Flera andra medlemmar av denna endoproteasfamilj har ett mer utbrett uttryck, medan ytterligare andra uttrycks på begränsade platser som skiljer sig från neuroner och endokrina celler. Furin finns till exempel i praktiskt taget alla celler och är främst lokaliserat till trans-Golgi-nätverket; furin katalyserar klyvningar som är viktiga för peptidfunktionen, t.ex. den initiala klyvningen av ELH-, nervtillväxtfaktor- och bisköldkörtelhormonprekursorerna samt klyvningen inom insulinreceptorprekursorn för att producera den aktiva αβ-dimerformen av receptorn. Furin kan också vara avgörande för aktiveringen av några av de andra bearbetningsenzymerna, såsom PC2 och CPE.

PC1 och PC2 klyver vid utvalda par av basiska aminosyror i peptidprekursorer: Lys-Arg, Arg-Arg, Lys-Lys och Arg-Lys. PC1 kan också katalysera klyvningar vid de utvalda enskilda Arg-platser som finns i vissa prekursorer, t.ex. prosomatostatin och procholecystokininin. Klyvningar i LDCVs av PCs är noggrant kontrollerade och sker ofta på ett mycket ordnat sätt (fig. 18-6). De första klyvningarna av POMC sker på mindre än 1 timme (fig. 18-6, steg 1 och 2), medan andra klyvningar sker först efter flera timmar (fig. 18-6, steg 6 och 7). Den endoproteolytiska klyvningen av propeptider är ofta den hastighetsbegränsande reaktionen i den peptidbiosyntetiska bearbetningen.

Mönstret av klyvningar som katalyseras av PC1, PC2 och furin när de uttrycks i neuroner och endokrina celler är mycket mer selektivt än det klyvningsmönster som ses i provrörsanalyser med renade enzymer. Även om prohormonkonvertaser vanligtvis klyver vid COOH-terminen av ett par basrester i modellpeptidsubstrat kan klyvningarna i cellerna till exempel ske i mitten av paren av basrester, som i fallet med POMC-klyvningen (fig. 18-6), där basresterna separeras och stannar kvar med de två resulterande mogna peptiderna . Det är troligt att Ca2+-koncentrationen och det inre pH-värdet i LDCVs är två variabler som används av neuroner och endokrina celler för att reglera den endoproteolytiska aktiviteten i LDCVs.

Det kan visa sig att ytterligare endoproteaser spelar en roll i neuropeptidbiosyntesen. Ledande kandidater är däggdjurshomologet till jästens aspartylproteas-3 (YAP-3) och N-arginin dibasiskt (NRD) convertas . En ytterligare vridning i peptidbiosyntesen ses i hjärtat, där proatrial natriuretisk faktor (proANF) lagras i LDCV:er, medan mogen ANF frigörs från förmaksceller till cirkulationen. Bearbetningen av proANF, som innebär klyvning efter en enda Arg-resurs i proANF, kan inte involvera PC1 eller PC2 eftersom det finns försumbara mängder av dessa PC i hjärtat.

CPE är ett lösligt protein som finns i praktiskt taget alla LDCV i neuroner och endokrina celler (fig. 18-5) . Det tar bort basiska rester, Lys eller Arg, från COOH-terminerna av peptidintermediärer som produceras av prohormonkonvertaserna. Den identifierades ursprungligen genom sin vävnadsdistribution och substratspecificitet, tillsammans med sin specifika hämning av guanidinoetylmerkaptosuccinsyra (GEMSA). CPE är ett Co2+- och Zn2+-aktiverat enzym med en kort proregion som normalt avlägsnas under enzymets mognad. Till skillnad från prohormonkonvertaserna är CPE aktivt när proregionen är fastsatt. Carboxypeptidasfunktionen vid peptidbearbetning är normalt inte hastighetsbegränsande eftersom peptidintermediärer med COOH-terminala basiska rester endast påvisas i extremt låga koncentrationer i vävnads- eller LDCV-extrakt. Nyligen har ytterligare karboxypeptidaser identifierats, särskilt CPD, en integral membranform av enzymet med tre karboxypeptidasdomäner. Den relativa betydelsen av CPE och dessa ytterligare karboxypeptidaser för bearbetningen av neuropeptider in vivo är oklar. Med tanke på att klyvningen vid ett par basiska rester kan ske i mitten av paret finns det goda skäl att tro att ett aminopeptidas kommer att hittas i LDCV:er.

PAM är ett bifunktionellt enzym som finns i nästan alla LDCV:er (fig. 18-5) . PAM verkar på peptidsubstrat efter endoproteolytisk klyvning och exopeptidasverkan, när en COOH-terminal Gly-resurs exponeras, och omvandlar peptidyl-Gly till motsvarande peptid-NH2. Ungefär hälften av de kända bioaktiva peptiderna är α-amiderade, och α-amidering är i allmänhet avgörande för den biologiska styrkan. Formerna peptidyl-Gly och peptid-COOH är vanligtvis inaktiva vid fysiologiska koncentrationer. Det första steget i α-amidationsreaktionen utförs av peptidylglycin α-hydroxylerande monooxygenas (PHM), som är den NH2-terminala delen av det bifunktionella PAM-proteinet. PHM binder två Cu2+-atomer som deltar i katalysen genom att genomgå cykler av reduktion och oxidation. PHM använder askorbinsyra som reduktionsmedel, med en syreatom från O2 inkorporerad i peptiden under hydroxyleringssteget. PHM är således enzymatiskt mycket lik dopamin β-mono-oxygenas (DBM), som omvandlar dopamin till noradrenalin (se kapitel 12). Det andra steget i α-amidationsreaktionen utförs av en andra enzymatisk domän av PAM, peptidyl-α-hydroxyglycin α-amidationslyas (PAL). PAL-domänen utgör ett nytt, tvåvärt metalljonberoende enzym. Neuroner uttrycker främst en integral membranform av det bifunktionella PAM-proteinet (fig. 18-5), medan en ytterligare mRNA-splicinghändelse gör det möjligt för vissa endokrina celler att uttrycka lösliga versioner av proteinet, som saknar transmembrandomänen. I de integrala membranformerna av PAM sträcker sig den korta COOH-terminala domänen in i cytoplasman och deltar i dirigering av PAM mellan LDCV:er och cellytan. Tillgången på reducerat askorbat i LDCV:erna upprätthålls av cytokrom B561, ett protein som har fem transmembrandomäner och som skickar elektroner från cytosoliskt askorbat till askorbat i LDCV:ernas lumen. Cytokrom B561 finns också i katekolamininnehållande vesiklar, där det fyller en liknande funktion för DBM (se kapitel 12). Nervösa och endokrina vävnader upprätthåller koncentrationer av reducerat askorbat ungefär 100 gånger högre än blodkoncentrationen av askorbat, medan de flesta andra vävnader inte koncentrerar askorbat.

Flera peptider har NH2-terminala pyroglutaminsyrarester, även kallade cyklisk glutaminsyra (<Glu), som är väsentliga för bioaktiviteten, till exempel thyrotropinfrisättande hormon (TRH) och gonadotropinfrisättande hormon (GnRH). Det enzym som ansvarar för detta steg är glutaminylcyklas, som omvandlar det ursprungliga NH2-terminala Gln till <Glu. Regleringen och funktionen av glutaminylcyklas har ännu inte studerats ingående. En annan viktig men sällsynt modifiering av peptider är α-N-acetylering (figurerna 18-6 och 18-7). Under POMC-bearbetning ökar α-N-acetylering kraftigt ACTH(1-13)NH2:s hudförmörkande potens samtidigt som både ACTH:s adrenala steroidogena potens och β-endorfins opiataktivitet avskaffas. Det eller de enzymer som ansvarar för denna modifiering har ännu inte renats eller klonats.

Som exempel visar figur 18-6 mönstret av bearbetningssteg i POMC-systemet . De inledande endoproteolytiska stegen (fig. 18-6, steg 1-4) förmedlas av PC1 och förekommer i alla POMC-producerande neuroner och endokrina celler, vanligtvis i den numeriska ordning som visas. Det är tydligt att steg 1 och 2 inleds i trans-Golgi-nätverket och fortsätter i LDCV, medan steg 4 endast sker i LDCV. Steg 5-7 inträffar endast i LDCV och verkar kräva PC2. I den vuxna främre hypofysen innehåller corticotroperna PC1 men inte PC2 och utför endast klyvning 1-4. Under den tidiga postnatala utvecklingen uttrycker dock corticotroperna också PC2 och klyvningssteg 5-7 ses övergående i corticotroperna. Hos råttan minskar uttrycket av PC2 och klyvningen inom ACTH (klyvning 5) samtidigt några veckor efter födseln, ungefär vid den tidpunkt då det vuxna mönstret av ACTH-kontroll över binjurebarkssteroidogenesen framträder.

Melanotropes och CNS-neuroner som tillverkar POMC uttrycker både PC1 och PC2 och därmed ses de mindre peptidprodukterna i dessa celler. PAM uttrycks i alla POMC-producerande celler, så α-amidering av joining peptide (JP), en liten peptid utan tydlig biologisk funktion, sker snabbt i alla POMC-celler (fig. 18-6). I melanotroperna i den intermediära hypofysen och i POMC-neuronerna i solitära traktens kärna sker α-N-acetylering av ACTH(1-13)NH2 och β-endorfin. I melanotropes kan α-N-acetylering av ACTH ske före klyvning 5. Som framgår av figur 18-4 bestämmer de särskilda klyvningar som görs och de modifieringar som görs av peptidprodukternas NH2- och COOH-terminaler vilken blandning av bioaktiva peptider som frigörs.