Abstract
Med allt bättre möjligheter att separera komplexa prover och detektera okända material har flytande kromatografi kopplat till masspektrometri (LC-MS) använts i stor utsträckning vid forskning om traditionell kinesisk medicin (TCM). I denna artikel beskrivs principerna för vätskekromatografi (LC) och masspektrometri (MS) samt deras för- och nackdelar vid kvalitativ och kvantitativ analys av TCM. Vi hämtade forskningslitteratur om tillämpningen av LC-MS i TCM som publicerats under de senaste fem åren i hemlandet och utomlands. För att bättre vägleda analysen av TCM fokuserar denna översikt främst på LC-MS:s tillämpningskategori, hur ofta olika typer av LC-MS används och den kvalitativa och kvantitativa förmågan hos olika LC-MS i studien av TCM.
1. Introduktion
Tusentals år av ackumulerad erfarenhet om liv och sjukdom som våra förfäder gjort har slutligen översatts till ett modernt apotek. Kinesiska örter, med komplexa och olika ingredienser, sätts vanligen i bruk på recept, enligt reglerna för monark, minister, assistent och guide. Vid tillämpningen kan mängden enskilda örter och läkemedelsformuleringar variera, vilket kan leda till förändringar i interaktionen mellan läkemedlen och den aktiva ingrediensen. På olika platser för läkemedelstillämpning kommer det att finnas skillnader i ingredienserna. På grund av komplexiteten i TCM:s kemiska sammansättning kan olika kemiska sammansättningar också reagera med varandra. Även om den praktiska tillämpningen har bevisat TCM:s effektivitet är det fortfarande svårt att förklara TCM:s specifika aktiva ingredienser i form av läkemedel inom den moderna vetenskapen. På senare år har en förenings in vivo-metabolism och verkningsmekanism blivit ett hett forskningsämne inom kinesisk medicin. Men dess egenskaper, såsom komplex sammansättning, verkningsmekanism med flera mål och flera verkningsformer samt ingrediensernas roll, ger forskningen om TCM en viss svårighet.
LC-MS integrerar helt och hållet den höga separationskapaciteten hos provet av LC för komplexa prover och den starka kvalitativa förmågan hos MS . På grund av dess höga känslighet och selektivitet har LC-MS-tekniken använts i stor utsträckning inom TCM-forskning.
2. LC
Kromatografi separerar blandningen med hjälp av skillnaderna i fördelningskoefficienten mellan de två faserna (mobil och stationär fas). Enligt den rörliga fasens tillstånd kan kromatografi delas in i gaskromatografi, vätskekromatografi och kromatografi med superkritisk vätska, medan kromatografi enligt den stationära fasens geometriska former kan delas in i kolonnkromatografi, papperskromatografi och tunnskiktskromatografi. Den vanligaste LC-metoden är kolonnkromatografi med vätska som rörlig fas. Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) är modifierad utifrån den klassiska vätskekolonnkromatografin.
Användningen av LC delas in i två kategorier. Den ena är kvalitativ eller kvantitativ för en viss sammansättning. Kvalitering hanteras enligt överensstämmelsen mellan provet och målkomponenten i topptiden . Kvantifiering sköts enligt den standardkurva som genereras efter att standarder injiceras på olika koncentrationsnivåer. Den andra är ett fingeravtryck som hänvisar till föreställningen att efter att fingeravtrycksprovet har disponerats på något sätt kan vi erhålla kromatogram eller spektrogram märkta kemiska egenskaper med hjälp av vissa analysmetoder.
LC har en stor fördel på förmågan att separera komplexa prover, så det är det effektivaste alternativet när det tillämpas för att separera blandningar, men inte lämpligt för att erhålla strukturell information om materialet . Kvalificering avslutad av kontrasten mellan topplägena för okända föreningar och standarderna är inte tillgänglig för övervakning av okända föreningar.
3. MS
Masspektrometri används i stor utsträckning inom TCM-forskningen på grund av dess höga selektivitet, höga känslighet och förmåga att tillhandahålla information, inklusive relativ molekylmassa och strukturella egenskaper. MS kompletterar kvalificeringen med hjälp av molekylmassa och relevant strukturell information och kompletterar kvantifieringen med hjälp av relationerna mellan toppen och det innehåll av föreningar som toppen representerade. Atmosfäriskt tryckjonisering (API) av MS har elektrosprayjonisering (ESI) och kemisk jonisering under atmosfäriskt tryck (APCI) . För många typer av föreningar har ESI hög känslighet. Jämfört med ESI är APCI lämplig för mindre polära föreningar och för analys av flyktiga föreningar. Beroende på skillnaderna mellan de massanalysatorer som används, avslutar vanliga MS quadrupolmassespektrum (Q-MS), time-of-flight-massespektrum (TOF-MS) och jonfälla-massespektrometri (IT-MS) .
Tandem-massespektrometri hänvisar till två eller flera MS som arbetar tillsammans. Den vanligaste tandemmassaspektrometrin är trippelkvadrupolmassaspektrometri (QQQ-MS). För att använda quadrupol för att utföra flerstegsmasspektrometri placeras tre quadrupoler efter varandra, vilket är trippelquadrupol . En annan typ av tandem-masspektrometri, t.ex. quadrupol-time-of-flight-masspektrometri (Q-TOF-MS) och quadrupol-jonfälla-tandem-masspektrometri (Q-IT-MS), består också av en mängd olika serier av kvalitetsanalysatorer . Jonfällans tidsserie kan åstadkomma MS-scanningar i flera steg sekventiellt vid olika tidpunkter, så i denna studie kategoriseras IT-MS som tandem-masspektrometer.
Tandem masspektrometri kan inducera fragment av molekylära joner som genereras av första steg MS, enligt vilket vi kan härleda förhållandet mellan barn och förälder, erhålla strukturell information om molekylen och sedan föreslå strukturen av föreningen och utföra kvalitativa analyser för kända och okända föreningar mer exakt.
Och även om MS kan ge strukturell information om ett material, kräver det högre renhet för provet. I TCM-forskning används den i allmänhet i kombination med LC.
4. LC-MS
LC-MS-tekniken, som använder LC som separationssystem och MS som detektionssystem, uppnår slutligen spektrumet. När LC och MS arbetar tillsammans kan de utföra flerstegs-MS för att spekulera i föreningens struktur och på så sätt slutföra kvalitativ och kvantitativ analys mer exakt .
Vid återvinning av de artiklar om LC-MS i tillämpningen av TCM-forskningslitteratur som publicerats under de senaste fem åren i hemlandet och utomlands, fann vi att de kunde delas in i två kategorier, det vill säga LC-Q-MS och LC-MS/MS. För att analysera skillnaderna och fördelarna och nackdelarna med varje metod klassificerades artiklarna enligt skillnaden i tandemmassaspektrometri.
4.1. LC-Q-MS
LC-Q-MS kan användas för att utföra kvalitativ och kvantitativ analys av standardkomponenter, enligt tabell 1. Vid kvalitativ analys kan vi få strukturell information genom att skanna positiva eller negativa joner . Vi kan också klargöra vilken typ av ämne den kemiska strukturen tillhör genom att jämföra den med standardlitteraturen . LC-Q-MS kvantifierar föreningar baserat på valet av specifika joner för övervakning . I avsaknad av standarder kan LC-Q-MS utföra den kvalitativa analysen av ämnet med hjälp av masspektrometrins starka kvalitativa egenskaper .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LC-Q-MS kan analysera ämnen kvalitativt, men vissa isomerer eller ämnen med identisk molekylvikt måste utforskas ytterligare, vars strukturer kräver ytterligare identifiering med hänvisning till flerstegsmasspektrometri. Dessutom leder en felaktig kvalitativ analys till en snedvridning av kvantifieringen.
4.2. LC-MS/MS
4.2.1. LC-IT-MS
IT-MS fångar olika kvalitetsintervall av joner med hjälp av olika storlekar på den RF-spänning som appliceras på ringelektroderna. Den har hög känslighet, och en enda IT-MS kan uppnå masspektrometriska funktioner på flera nivåer.
IT-MS kan realisera tidsserier med flera MS-skanningar i olika kronologiska ordningar, vilket ger en ingående MSn-fragmentering; den lämpar sig således för kvalitativa frågor och ger strukturell information för identifiering av okänd sammansättning, vilket visas i tabell 2. I studien av TCM används LC-IT-MS vanligen vid kvalitativ sammansättning .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4.2.2. LC-QQQ-MS
Triple quadrupole innebär att tre quadrupoler är ordnat placerade. Varje kvadrupol har en separat funktion. Skanningslägena för trippelkvadrupolen omfattar fullt skanningsläge, skanningsläge för produktjoner, skanningsläge för moderjoner, skanningsläge för neutral förlust, skanningsläge för utvalda joner och skanningsläge för övervakning av multipla reaktioner .
LC-QQQQ-MS används huvudsakligen för kvantifiering , vilket framgår av tabell 3. Vissa studier används för kvalificering . Jämfört med LC-Q-MS kan LC-QQQQ-MS välja ut vissa joner som ska kollidera och analysera fragmenten efter kollisionen. LC-QQQQ-MS kan detektera moderjonen och dotterjonen samtidigt, vilket gör den exakt, känslig och heltäckande. LC-QQQQ-MS kan tillämpas på ett större område. Jämfört med andra tandemmassaspektrometrier har trippelkvadrupol den bästa kvantitativa reproducerbarheten. LC-QQQ-MS är den mest kända kvantitativa metoden för substanser.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4.2.3. LC-Q-TOF-MS
LC-Q-TOF-MS används i allmänhet för kvalificering. Den har högre detektionskänslighet och massupplösning. LC-Q-TOF-MS kan noggrant mäta massan .
LC-Q-TOF-MS används huvudsakligen för kvalitativ materialanalys , enligt tabell 4. Jämfört med flera andra tandemmassaspektrometrar har den fördelar när det gäller detektionskänslighet, massnoggrannhet och upplösning. Hög upplösning och massprecision ger LC-Q-TOF-MS bättre kvalitativ förmåga för fragmentjoner. Det är också mer övertygande när det gäller att särskilja joners struktur och isomerer förutom att analysera okända strukturer med denna metod .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5. Slutsatser
Vid jämförelse med LC-MS och LC-MS/MS bedrivs forskningen av LC-MS/MS relativt mer, vilket har en högre noggrannhet i den kvalitativa analysen för kända och okända föreningar. LC-IT-MS har på grund av sin förmåga till flera nivåer av masspektrometri en bättre prestanda vid bedömning av en okänd sammansättningsstruktur. LC-Q-IT-MS har en bättre upplösningskvalitet än LC-IT-MS. Jämfört med de tre andra typerna av LC-MS/MS har det visat sig att LC-QQQ-MS oftare används för forskning och har en bättre kvantitativ förmåga än andra. Dess kvalitativa förmåga är god, men ännu inte lika bra som LC-Q-TOF-MS. LC-Q-TOF-MS används huvudsakligen för kvalitativ analys av materia. Vissa av dess förmågor är relativt utmärkta, t.ex. känslighet för detektion, massnoggrannhet och upplösning.
De kvalitativa metoderna skiljer sig åt mellan olika LC-MS-metoder, medan de kvantitativa metoderna i princip är desamma, eftersom alla kvantitativa metoder kräver standard med olika koncentrationer. Kvantitativa metoder delas vanligtvis in i två olika typer: extern standardmetod och intern standardmetod. Extern standardmetod innebär att man för att genomföra den kvantitativa analysen först genererar en standardkurva vars horisontella axel representerar koncentrationer och vars vertikala axel representerar färgtoppens spektrumområde. Därefter kan den kvalitativa analysen utföras enligt toppområdet. Intern standardmetod innebär att den interna standarden med känd koncentration först tillsätts till lösningarna av provet och hybridreferenssubstansen; därefter skapas en standardkurva vars horisontella axel representerar förhållandet mellan koncentrationen av referensprovet och koncentrationen av det interna standardprovet och vars vertikala axel representerar förhållandet mellan standardtoppområdet och toppområdet för den interna standarden. Slutligen injiceras det interna standardprovet. Enligt testindikatorernas och den interna standardens toppområde kan en kvalitativ analys göras.
I forskningen om TCM dras slutsatsen att LC-Q-TOF-MS är ett bättre val för kvalitativ analys medan LC-QQQQ-MS visar sig vara bättre för kvantitativ analys. Kvantitativ analys utförs med hjälp av specifik standard med specifik koncentration. Kvalitativ analys kan mäta strukturen hos vissa okända ingredienser och spekulera i deras tillskrivningar i enlighet med den information som tillhandahålls av befintlig forskningslitteratur och databas. Standardvalidering är den mest exakta metoden för kvalitativt material. På grund av TCM:s komplexa sammansättning och okända förmågor kan forskningsmetoderna relativt sett inte tillgodose behovet ännu. Ytterligare forskning och utforskning är fortfarande nödvändig.
Kompletterande intressen
Alla författare förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (National Natural Science Foundation of China) (nr. 81273925).