Kondensorn – olika typer. Kontrast i mikroskopet
I den föregående artikeln om okularet påpekade jag att okularet normalt var placerat så att dess främre brännpunktsplan var samfällt med det primära bildplanet (PIP). PIP är konjugerat med provet i den avbildande uppsättningen konjugerade plan och är därför användbart för att mäta egenskaper hos mikroskopiska prover.
På samma sätt är kondensorns främre brännpunktsplan konjugerat med objektivets bakre brännpunktsplan (men inte med provet) i belysningsstrålarnas tåg av strålar. Kondensorn utgör därför en tillgänglig plats där vi kan ändra eller reglera bildens kontrast genom att manipulera de belysande ljusstrålarna. Dessa två principer härrör från Köhlers belysningsmetod, som behandlades i del 3 av denna serie.
Kondensorns funktion
Kondensorn fyller två funktioner i mikroskopet. Den ger ett område med jämnt belyst ljus i synfältet vid preparatplanet och belyser objektivets öppning jämnt med ljus med tillräcklig men kontrollerbar vinkel. För det andra ger den, som nämnts ovan, ett sätt att reglera kontrasten (Bradbury & Evennett, 1996). Den enklaste formen av kondensor är den konkava spegeln, men den är inte användbar för objektiv över NA 0,2 eller så. Om ditt mikroskop har en spegel och en avlägsen ljuskälla måste spegelns platta sida användas tillsammans med en eventuell monterad substage-kondensor. Detta beror på att kondensorn strikt sett ska ta emot parallell belysning och därmed föra detta ljus till ett fokus vid kondensorns bakre fokalplan (där provet befinner sig).
Typer av kondensor
Den mest använda typen av kondensor är Abbe-kondensorn för ljusfältsmikroskopi (figur 1a, 1b). Den är uppbyggd av två eller tre linser, och den övre kortfokuslinsen kan vanligen vändas ut ur den optiska banan (1a), eller skruvas loss (1b), för att fylla synfältet med objektiv med låg effekt. Denna enkla belysare räcker för de flesta typer av mikroskopi. Den var ursprungligen utformad för att ge smala strålar (eller ”pennor”) av snett ljus från en excentriskt placerad öppning i kondensorns främre fokalplan. Figur 1c visar en enkel Abbe-belysare med två linser monterad på en substageapparat som kunde roteras och flyttas excentriskt för att ge snedbelysning. Figur 1d visar en kondensor med låg effekt som är utformad för att helt fylla det stora synfältet hos objektiv med mycket låg förstoring.
Och även om en numerisk apertur kan anges för kondensorn (ofta 0,9 NA för torra kondensorer och högst 1,4 NA för oljedimmersionstyper) ger dessa siffror ingen indikation på den NA för vilken belysningsstrålarna är korrigerade för sfärisk aberration. I många enkla kondensorer är en fast ljuskägla för axial belysning sällan korrigerad för sfärisk aberration över 0,45 NA. För arbete av hög kvalitet och för att lösa upp strukturer vid upplösningsgränsen måste kondensorer korrigeras för aberrationer. Fullständigt korrigerade kondensorer, liksom objektiv, innehåller många linselement och kan korrigeras i nästan samma utsträckning. Den akromatisk-aplanatiska kondensorn (1e) är korrigerad för både sfärisk och kromatisk aberration och bör användas för arbete av högsta kvalitet och för färgfotomikrografi. Aplanatiska kondensatorer korrigeras endast för sfärisk aberration.
Så kallade ”universella” kondensatorer (figur 2) är multifunktionella. De består av en roterande skiva som innehåller ett urval av bländarbländare, filter, patch stops, fasplattor eller Wollastonprismor för differentiell interferenskontrast (DIC). Detta arrangemang gör det möjligt att byta från en kontrastmetod till en annan på ett bekvämt och enkelt sätt. Den mörka markbländaren fungerar i allmänhet endast upp till NA 0,5 eller däromkring. För användning med objektiv med högre NA måste en speciellt konstruerad mörkmarkskondensor (figur 3) användas. För detaljer om dess användning och andra metoder för kontrastförbättring, se Bradbury & Evennett (1996).
Figur 2. Universella kondensatorer. Den centrala bilden visar det övre locket borttaget, vilket visar den roterande skivan där öppningens fasannuli, DIC-prismorna, mörkergrundsfläckstopparna, Rheinberg-skivorna och Hoffman-moduleringsfiltren är placerade. De flesta universalkondensatorer har en öppningsiris för arbete i ljusfält, flera annuli för faskontrast och ett mörkergrundstopp för mörkergrund med låg effekt.
Figur 3. Kondensatorer för mörkgrund. 3(a) Torr mörkgrundskondensor. 3(b) & 3(c) Kondensatorer med oljedoppning. Denna kondensor kan justeras för att passa olika tjocklek på objektglaset och ge en mörkgrundsbild av hög kvalitet.
Sänd- och reflekteratljusmikroskopi
Inrättandet av sändljusmikroskopet kräver en separat kondensor, eftersom ljuset först kondenseras på provet (där ljuset interagerar med materia) och sedan samlas in av objektivet längre bort längs den optiska axeln.
Situationen i reflekteratljusmikroskopet är annorlunda. Här är strålbanan viktad runt provets axel där ljuset reflekteras från dess yta. Objektivet fungerar som sin egen kondensor, och inriktningen av reflektionsljusmikroskopet är mycket förenklad (se stråldiagrammen i del 2 i denna serie). Det är dock svårt att komma åt objektivets bakre brännpunktsplan (främre brännpunktsplan när det används som kondensor), så därför används tilläggslinser för att skapa ett läge där bilden av bländare och filter är konjugerad med det bakre brännpunktsplanet.
Incidentljus-systemet är mycket användbart för fluorescensmikroskopi, främst för att belysningen av provet är enkel, det är effektivare (ger ljusare bilder vid höga förstoringar) och kombination med andra kontrastmetoder genom genomlysning är tillåten.
Figur 4. Illustration av en epi-illuminator för mikroskopi med reflekterat ljus
Denna epi-kondensor har två typer av objektiv med reflekterat ljus monterade i sitt nosstycke. Det objektiv som används är konstruerat för belysning i mörker, medan de andra två objektiven som kan ses är avsedda för arbete med reflekterat ljus i ljusfält. De breda kragarna runt de två sistnämnda objektiven gör att objektivet kan centreras på den optiska axeln. ”D” på epi-illuminatorhöljet betecknar den utbytbara insats som gör det möjligt att använda enheten för mörkfältsbelysning. Den kan bytas ut mot en plan spegel för ljusfältsmikroskopi med reflekterat ljus. Om objektivet fungerar som sin egen kondensor vid reflekterad ljusmikroskopi, varför används då inte också objektiv för belysning vid genomlysningsmikroskopi? Bortsett från den praktiska svårigheten att komma åt objektivets bakre brännpunktsplan är det svårt att använda objektiv med flera funktioner, och belysningsvinkeln kan vanligen inte regleras (med hjälp av en irisbländare i objektivets bakre brännpunktsplan).
Grundläggande principer för kontrastförbättring
För att vi ska kunna uppfatta detaljerna i den bild som upplöses av våra mikroskop krävs tillräcklig synlighet, eller kontrast. Selektiviteten är viktig: vi behöver åtminstone vissa regionala skillnader inom objektet och mellan objektet och bakgrunden för att kunna urskilja detaljer.
Kontrast i bilden fås på tre sätt, antingen separat eller i kombination. De är:
- interaktion mellan objekt och ljus,
- manipulering av belysningen och
- manipulering av bildinspelningsmediet.
Kontrastförändring i del c) kan åstadkommas genom fotografisk framkallning och/eller utskrift, och även med hjälp av elektronisk kontrast av analoga video- eller digitala bilder. Kondensorn är dock avgörande i delarna (a) och (b) för att manipulera kontrast och synlighet i bilden. Ytterligare detaljer om de teoretiska och praktiska aspekterna av kontrastteknik i ljusmikroskopi finns i Bradbury & Evennett, 1996 och Sanderson, 2002, 2000, 1998 och 1994. Kortfattat kan man säga att de mest kända formerna av kontrastgenerering är ljusfält, snedbelysning, mörkergrund & Rheinberg, faskontrast och DIC. Det är också möjligt att kombinera dessa metoder med olika former av belysning (t.ex. polariserat ljus med Rheinberg eller faskontrast genom transmittat ljusfält med infallande fluorescens). Eftersom kontrastförbättringen i hög grad ligger under mikroskopistens kontroll kan betydelsen av korrekt användning av kondensorn inte nog betonas.
Kondensorn måste fokuseras korrekt (se del 3, inställning av mikroskopet för Köhler-belysning) för att man ska få en bild av bästa kvalitet. Detta gäller oavsett vilken metod för kontrastförbättring (ljusfält, fas, mörkergrund) som används. Den mest uppenbara effekten av en ofokuserad kondensor vid ljusfältsmikroskopi är en betydande förlust av upplösningsförmåga, vilket i sin tur ger en ”rutten” bild med diffraktionshalo runt varje punkt i bilden. Samma resultat uppstår om den övre (kortfokuserade) linsen utelämnas eller lämnas utfälld när ett objektiv med hög effekt används, och objektivets bakre fokalplan inte fylls helt med ljus.
När faskontrastmikroskopi försöks med en felaktigt fokuserad kondensor, kommer ringringen i kondensorn ofta inte att motsvara diametern på fasringen i objektivets bakre fokalplan, och all kontrastförbättring går förlorad. Problem med att fokusera kondensorn kan också leda till dålig mikroskopi i mörkerbotten, om bilden av lappstoppet inte helt täcker den direkta belysningen från objektivet. Nästa del i denna serie återvänder till objektivet och behandlar rörlängd och hur man bestämmer brännvidd, förstoring, bländare och andra parametrar för sina objektiv.
Bradbury S. & Evennett P. J. (1996) Contrast Techniques in Light Microscopy. Bios Scientific Publishers. ISBN 1-85996-085-5
Sanderson, J. B. (1994) Contrast in Light Microscopy: An Overview. Proceedings of the Royal Microscopical Society 29/4:263-270
Sanderson, J. B. (1998) Contrast Enhancement Techniques for Light Microscopy in Cell Biology: A Laboratory Handbook 2nd Edn. Cellis, J. (red). (1998) Vol 3: 15-33, Academic Press. ISBN (4-vol set) 0-12-164725-0; endast vol 3 = 0-12-164728-5
Sanderson, J. B. (2000) The Theory of Contrast Control in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 38:617-627.
Sanderson, J. B. (2002) Practical Control of Contrast in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 39:275-288.