Zróżnicowany wpływ na przepuszczalność błon i żywotność ludzkich komórek keratynocytów poddawanych działaniu pól megasłonecznych o bardzo niskim natężeniu

Na komórkach HaCaT badano wpływ ekspozycji na ultradźwięki o bardzo niskim natężeniu (Ispta pomiędzy 7 a 16 mW/cm2, znacznie poniżej progu kawitacji, 100 mW/cm2) o częstotliwości 1 MHz. Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu równoważnego zestawu medycznego przedstawionego na rysunku S1 w ESI, przy różnych parametrach obróbki, takich jak Ispta, cykl pracy i czas sonikacji. Wstępne eksperymenty wykazały, że w zakresie parametrów naświetlania, o których mowa w niniejszej pracy, temperatura pozostawała stała (w granicach 1 °C), z wyłączeniem termicznej dyssypacji energii US. Ponadto, nie wykazano istotnej zależności badanych efektów od cyklu pracy fali US. Obserwacje te są zgodne z niską absorpcją US przy 1 MHz; przeciwnie, efekty termiczne i cykl pracy mogą wpływać na komórki i tkanki wystawione na działanie wyższych częstotliwości, ponieważ współczynnik tłumienia US jest proporcjonalny do częstotliwości23,31.

Wyniki zostaną wstępnie przedstawione z uwzględnieniem dwóch istotnych parametrów ekspozycji, czasu sonikacji i Ispta, oddzielnie. Strukturalne i fizyczne zmiany błony komórkowej (przepuszczalność, wydajność wychwytu i maksymalny rozmiar internalizowanych cząsteczek) zostaną przeanalizowane i skorelowane z odpowiednimi uszkodzeniami cytotoksycznymi i możliwą aktywacją wzorców zapalnych. Następnie, wyniki zostaną zinterpretowane pod kątem dawki sonikacji, zdefiniowanej jako iloczyn Ispta i czasu ekspozycji, czyli gęstości powierzchniowej energii akustycznej padającej na próbkę podczas sonikacji. W rzeczywistości badane zjawiska zależą od tej wielkości, co pozwoliło nam zidentyfikować zakres parametrów ekspozycji, przy których występuje przejściowe SP z pomijalnymi uszkodzeniami biologicznymi.

Analiza wpływu czasu ekspozycji na US

Zmiany w przepuszczalności błon komórek HaCaT indukowane przez US o niskiej intensywności 1 MHz zostały oszacowane pod względem wydajności wychwytu zielonej sondy fluorescencyjnej kalceiny. Ponieważ nienaruszone błony są nieprzepuszczalne dla kalceiny, stanowi ona wiarygodny marker dla SP. Procent komórek zielono-dodatnich został określony ilościowo przez analizy cytometrii przepływowej zgodnie z sekcją 2.5.

W celu oceny wrażliwości przepuszczalności membran na czas ekspozycji US, użyto bardzo niskiego US Ispta. W szczególności, już Ispta 7 ± 1 mW/cm2 znaczący wpływ na przepuszczalność błony może być wywołany przez odpowiednie czasy ekspozycji. Reprezentatywne wyniki równoległej cytometrii przepływowej na komórkach HaCaT i NIH-3T3 poddanych sonikacji przy Ispta ~7 mW/cm2 przez 5′, 15′, 30′ i 45′ przedstawiono na Rys. 1 (odpowiednio czerwone trójkąty i niebieskie kwadraty). Zgodnie z oczekiwaniami, porównanie linii komórkowych po niskich czasach sonikacji (poniżej progu sonoporacji) skutkuje małym powinowactwem kalceiny, przy czym różnice (największe w komórkach HaCaT) powinny wynikać z ich odpowiednich cech składu i przepuszczalności błon. Co ważniejsze, obie linie komórkowe wykazują znaczący wzrost wydajności wychwytu począwszy od 15′ ekspozycji, co odpowiada dawce sonikacji (6,3 ± 0,9) J/cm2 , sugerując aktywację procesu SP. Zgodnie z najlepszymi dopasowaniami na Rys. 1, dla dłuższych czasów ekspozycji, nasze eksperymenty wskazują na liniową korelację pomiędzy wydajnością absorpcji a czasem ekspozycji, z identyczną szybkością absorpcji indukowaną przez US zarówno w komórkach HaCaT jak i NIH-3T3 (nachylenia regresji liniowej (%/min) 1,3 ± 0,2 i 1,4 ± 0,2, odpowiednio dla HaCaT i NIH-3T3). Oznaczałoby to, że wzrost wydajności wychwytu spowodowany SP jest zjawiskiem niezależnym od linii komórkowej.

Aby dokładniej zbadać proces SP i scharakteryzować internalizację, traktowane komórki HaCaT oceniano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Zgodnie z wynikami cytometrii przepływowej, próbki poddane sonikacji przez 5′ nie wykazują żadnych znaczących zmian w przepuszczalności błony w odniesieniu do próbki kontrolnej (nie poddanej działaniu SP), podczas gdy począwszy od 15′ obserwuje się rosnącą wydajność wychwytu (jak pokazano na Rys. 2 i Rys. S2 ESI), chociaż nie wszystkie komórki wykazywały fluorescencję. Odpowiednio, komórki wydają się mniej gęste i przylegające w odniesieniu do próbki kontrolnej, co sugeruje rozluźnienie ścisłych połączeń. Reprezentatywne obrazy z Rys. 2 sugerują heterogenną lokalizację kalceiny w obrębie komórek i w rzeczywistości konfokalna mikroskopia fluorescencyjna pozwoliła wyraźnie odróżnić w komórkach HaCaT obwodowe rozmieszczenie sondy od wewnętrznego (patrz obraz i rekonstrukcje 3D na Rys. 3). Dalsze szczegółowe obrazy są przedstawione w sekcji 3 ESI. Obserwacje są zgodne z dwupoziomowym wychwytem fluoroprobozy: peryferyjnym, gdzie sonda jest zlokalizowana w sieci retikulum endoplazmatycznego wokół błony plazmatycznej; drugim, widocznym znacząco po ekspozycji 30′, gdzie dyfuzja sondy do cytoplazmy powoduje intensywną fluorescencję równomiernie rozłożoną w całej komórce, włączając w to nukleoplazmę. Należy zaznaczyć, że średnica Stokesa kalceiny wynosi ~1,36 nm i jej transport wewnątrzjądrowy nie jest utrudniony przez bariery dyfuzyjne29. Pełniejsza analiza przedstawiona w rozdziałach 3.2 i 3.3 pozwala stwierdzić, że dawka ekspozycji US i masa cząsteczkowa sondy były dominującymi czynnikami w determinowaniu wychwytu.

Dalszy test oparty na czerwonej fluoroprobe PI został przeprowadzony w celu oceny odzyskania natywnej przepuszczalności błony sonikowanych komórek (patrz również Sekcja 2.3). Internalizacja PI oznacza aktywację procesów cytotoksycznych. Współlokacja zielonego i czerwonego barwnika wewnątrz komórek wskazuje zatem na niepowodzenie procesu odbudowy błony po SP. Z drugiej strony, obserwacja w komórkach zielonej fluorescencji przy braku czerwonej wskazuje na wyst±pienie błonowego SP w trakcie terapii US i jego skuteczn± odbudowę po wył±czeniu pola. Reprezentatywne obrazy fluorescencji konfokalnej przedstawiono na ryc. 4. Współlokacja obu barwników jest nieobecna w komórkach traktowanych przez 15′, podczas gdy jest ledwo obserwowana po 30′ ekspozycji (Rysunek S5 ESI). Konsekwentnie, wykazano utratę netto żywotności o ~5%, jak sprawdzono za pomocą cytometrii przepływowej. W komórkach poddanych sonikacji przez 45′, co odpowiada dawce (19 ± 3) J/cm2, kolokalizacja jest bardziej widoczna (patrz białe strzałki na Rys. 4B) i występuje bardziej znacząca utrata żywotności (~10%, jak sprawdzono za pomocą cytometrii przepływowej). Wyniki te sugerują, że dłuższy czas ekspozycji, odpowiadający wyższej dawce przy stałej Ispta, wywołuje nieodwracalną zmianę w strukturze błony, a następnie konsekwentną odpowiedź cytotoksyczną.

Analiza wpływu intensywności US

Na linii komórkowej HaCaT analizowano wpływ zróżnicowania intensywności stosowanego pola US na przepuszczalność błony po 15′ ekspozycji, wystarczająco krótkiej, aby wykluczyć efekty wywołane długotrwałą sonikacją. W naszych badaniach natężenia US mieściły się w zakresie od Ispta = (7 ± 1) mW/cm2 do Ispta = (16 ± 1) mW/cm2, znacznie poniżej progu kawitacji24. Zgodnie z protokołem opisanym w sekcjach 2.3 i 2.5, dekstrany znakowane FITC o różnym MW (MW = 10, 40 i 70 kDa) zostały użyte do scharakteryzowania, dla każdej intensywności US, indukcji przepuszczalności błony dla różnych rozmiarów cząsteczek. Procedura ta pozwala z kolei na ocenę wielkości sonoporu. Podobnie jak kalceina, dekstrany nie wnikają znacząco do nietraktowanych komórek31,32, podczas gdy w reżimie kawitacyjnego US wychwyt komórkowy dekstranów znakowanych FITC może być silnie zwiększony zarówno przez SP, jak i przez promowanie traffikacji endosomów30. W związku z tym, wyniki pomiarów cytometrii przepływowej przedstawione na Rys. 5 wyraźnie wskazują na zależny od wielkości pobór, zjawisko, które pozwala wykluczyć współwystępowanie efektów aktywnej endocytozy i, zgodnie z literaturą22, sugeruje wyzwalane niskim natężeniem SP jako główny mechanizm zaangażowany w transport cząsteczek dekstranu przez błonę plazmatyczną. W szczególności, obserwowany pobór indukowany SP charakteryzuje się progiem Ispta, liniowo wzrastającym wraz ze wzrostem MW internalizowanych cząsteczek. Poniżej tego progu wydajność wychwytu w komórkach poddanych działaniu SP jest porównywalna z wydajnością wychwytu w komórkach nie poddanych działaniu SP. Wartości progowe Ispta zostały przedstawione w tabeli 1. Dla natężeń powyżej progu, wydajność wychwytu wzrasta wraz ze wzrostem Ispta, aż do osiągnięcia maksimum. W przypadku dekstranu o masie 10 kDa wydajność ta nieznacznie spada, osiągając plateau. Obserwowany spadek wydajności wychwytu przy wysokich intensywnościach można tłumaczyć wzrostem liczby martwych komórek, które są usuwane z próbki podczas płukania, a tym samym nie biorą udziału w analizach cytometrii przepływowej. Ponadto, aktywacja procesów apoptotycznych może utrudniać internalizację barwnika. Warto zauważyć, że dla Ispta = 15 mW/cm2 , mimo że wartość ta jest znacznie niższa od progu kawitacji, komórki są w stanie internalizować dekstrany 70 kDa, o średnicy Stokesa ~12 nm. Wartość ta może być przyjęta jako szacunkowa minimalna wielkość sonoporów wytwarzanych w błonie. Na rysunku S6 (sekcja 4 ESI) przedstawiono zestaw reprezentatywnych obrazów fluorescencyjnych przedstawiających wychwyt dekstranów przy progu Ispta wraz z testem PI.

Internalizacja PI wskazuje na znaczącą odpowiedź cytotoksyczną przy Ispta = 15 mW/cm2 (dawka ekspozycji 13,5 J/cm2). Jak donoszą Udroiu i wsp.13 w podobnych warunkach doświadczalnych obserwowano również niewielki, ale istotny wzrost częstości występowania mikrojąder w komórkach NIH-3T3, w zależności od intensywności i czasu ekspozycji na 1 MHz US. Obserwacje te sugerowały konieczność przeprowadzenia dalszych badań w celu lepszego zrozumienia bioefektów towarzyszących membranowym SP, dlatego też przeprowadzono badanie odpowiedzi biologicznej sonikowanych komórek w funkcji intensywności US.

Odpowiedź biologiczna na „rany membranowe” wywołane SP przy bardzo niskich intensywnościach US została dokładnie scharakteryzowana poprzez ocenę śmierci komórek, przy użyciu połączonego testu AnnexinV i PI opisanego w sekcji 2.5 (patrz również sekcja 5 ESI). Oceniliśmy również ekspresję genu IL-6, cytokiny łączącej przewlekły stan zapalny z rakiem33,34. Wyniki analizy cytometrii przepływowej, wyrażone w procentach komórek, przedstawiono na Rys. 6. Żywotność komórek jest w większości zachowana (>90%) podczas zabiegów 15′, niemniej jednak począwszy od Ispta = 9 mW/cm2 następuje nieznaczny spadek, któremu towarzyszy wzrost liczby komórek wczesnoapoptotycznych. Przy Ispta = 14 mW/cm2 zaczyna się obserwować znaczny odsetek komórek nekrotycznych, natomiast przy Ispta = 16 mW/cm2 również późna apoptoza przyczynia się do śmierci komórek, w korespondencji z nieznacznym zmniejszeniem nekrozy (reprezentatywne wykresy kropek cytometrii przepływowej w Figure S7 ESI). Ekspresję genu IL-6 oznaczono metodą RT-PCR (ryc. 7). Nie zaobserwowano wzrostu ekspresji w przypadku Ispta ≤15 mW/cm2, podczas gdy leczenie przy 16 mW/cm2 indukowało nadekspresję tego genu w porównaniu z komórkami nieleczonymi.

Wyniki te sugerują, że począwszy od progu Ispta wynoszącego 16 mW/cm2 i 15′ sonikacji, uszkodzenie błony wywołane przez US nie tylko zmniejsza żywotność komórek, ale również, poprzez nadekspresję genu związanego z zapaleniem IL-6, może indukować odpowiedź zapalną. Ponieważ w kilku badaniach uznano rolę stanu zapalnego w promowaniu patogenezy i progresji chorób takich jak nowotwory35,36, konieczne są dalsze badania w celu lepszego scharakteryzowania aspektów związanych z wzorcami zapalnymi.

Analiza wpływu dawki sonikacji

Aby ilościowo przeanalizować związek między zastosowanym polem US a obserwowanymi efektami biologicznymi pod względem energii dostarczonej do komórek podczas ekspozycji, dawkę sonikacji obliczono dla każdego zabiegu jako iloczyn intensywności Ispta przez czas ekspozycji. Uzyskane wartości przedstawiono w tabeli 2, gdzie obserwowane efekty biologiczne oznaczono kolorami tła. Nasze wyniki sugerują, że membranowe SP występuje począwszy od dawki progowej wynoszącej około 6,3 J/cm2. Ponadto, wielkość sonoporów może być związana z dawką sonikacji. Dla dawek wyższych niż 10,8 J/cm2 obserwuje się spadek żywotności i towarzyszącą temu wczesną apoptozę, a od dawki 14,4 J/cm2 późną apoptozę, nekrozę i nadekspresję IL-6.

Podkreślamy, że ta dawka, i Ispta 16 mW/cm2, odpowiada ujemnemu ciśnieniu szczytowemu ~0,02 MPa. Wartość ta wydaje się wystarczająco wysoka, aby wywołać naprężenia mechaniczne na granicy błona plazmatyczna/woda, chociaż jest o jeden rząd wielkości niższa niż proponowana dotychczas wartość progowa bezpiecznego narażenia (indeks mechaniczny ~0.2-0.3, przy 1 MHz).

Zauważmy, że nasze eksperymenty zostały z powodzeniem porównane z eksperymentami przeprowadzonymi przy użyciu systemu elektromedycznego faktycznie stosowanego w terapii USG (patrz również Sekcja 2.2), podkreślając w ten sposób medyczne znaczenie naszego podejścia. Jesteśmy przekonani, że dostarczenie informacji o dawce sonikacji (przy stałej częstotliwości US) pozwala na pełniejszą charakterystykę odpowiedzi komórek na ekspozycję na US, a tym samym na dokładną identyfikację zakresu parametrów, w których przejściowe SP występuje z nieistotnymi uszkodzeniami biologicznymi.

Bardzo ważnym krokiem w kierunku zrozumienia biologicznego wpływu naszych wyników in vivo byłoby operowanie ekspozycjami US na trójwymiarowe biosystemy, takie jak ludzkie tkanki złożone z wielopoziomowych cheratynocytów lub z komórek śródbłonka bariery krew-mózg.

.