The Discovery of Water Channels (Aquaporins)

Abstract

Ruch wody do i z komórek jest fundamentalnym procesem biologicznym, który jest niezbędny do życia. Taki ruch wody nie tylko reguluje aktywność pojedynczych komórek, ale także odpowiada za funkcjonowanie wielu układów narządowych oraz za utrzymanie równowagi wodnej całego organizmu. Od dawna podejrzewano, że ruch wody przez biologiczne błony komórkowe jest w jakiś sposób wzmacniany lub ułatwiany przez pory lub kanały, ale poszukiwania mające na celu zidentyfikowanie tych kanałów były długie i żmudne. Jak to często bywa w nauce, tajemnica kanału wodnego została w końcu przypadkowo odkryta w 1992 r. przez Petera Agre’a i jego współpracowników z Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa w Baltimore, którzy pracowali nad białkami błonowymi krwinek czerwonych. Ten „pierwszy” kanał wodny nosił pierwotnie nazwę CHIP28, a obecnie znany jest jako akwaporyna 1. Za to odkrycie Agre otrzymał w 2003 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii. Obecnie u ssaków znanych jest 13 akwaporyn, rozmieszczonych w większości tkanek, ale u organizmów niższych i w królestwie roślin zidentyfikowano ich znacznie więcej. Zaangażowanie akwaporyn w procesy takie jak stężenie moczu i homeostaza płynów ustrojowych, funkcjonowanie mózgu, wydzielanie gruczołów, nawilżanie skóry, męska płodność, słuch, wzrok i większość ważnych funkcji organizmu, jakie można sobie wyobrazić, są obecnie przedmiotem intensywnych badań naukowych. Co więcej, defekty w funkcji akwaporyn zostały powiązane z różnymi stanami chorobowymi i patologicznymi. W tym krótkim przeglądzie omówione zostanie ich pochodzenie, odkrycie i funkcja w wybranych procesach ustrojowych, szczególnie skupiając się na nawodnieniu.

© 2017 The Author(s) Published by S. Karger AG, Basel

Why Are We Interested in Water Channels?

Komórki, które tworzą nasze ciała, składają się w większości z wody. Około 65% komórki to woda. Pod względem całkowitej masy ciała, niemowlęta są najbardziej „soczyste”, składając się w 75% z wody; chude osoby dorosłe zawierają 60% wody, podczas gdy starsze osoby dorosłe zawierają tylko 50% wody. Większość suchej masy ciała, która nie zawiera wody, to kości. Dla porównania, prawdopodobnie najbardziej zasobnym w wodę organizmem jest sałata (95% wody), podczas gdy my, ludzie, jesteśmy porównywalni do banana (65% wody). W toku ewolucji komórki wszystkich organizmów zostały przystosowane do optymalnej pracy w takim środowisku wodnym, a znaczne różnice w zawartości wody w komórkach spowodują koncentrację lub rozcieńczenie ich składników molekularnych i uniemożliwią normalne funkcjonowanie. Dlatego też komórki muszą regulować ilość wody, która wchodzi i wychodzi przez ich błonę plazmatyczną, aby regulować cytozolowe stężenie rozpuszczalników, jonów, elektrolitów, białek i kwasów nukleinowych. Ponadto, ilość wody w przestrzeniach pozakomórkowych w organizmie jest również ściśle kontrolowana. U ludzi i innych ssaków obejmuje to, ale nie jest ograniczone do objętości krwi, przestrzeni śródmiąższowej poza naczyniami krwionośnymi, płynu mózgowo-rdzeniowego, wodnistego humoru w oku i wydzielin gruczołów.

Dlaczego potrzebujemy kanałów wodnych?

Aby poradzić sobie z ciągle zmieniającymi się wymaganiami metabolicznymi i otaczającymi warunkami, komórki muszą szybko wymieniać wodę między swoją cytoplazmą (wewnątrz) i środowiskiem zewnętrznym (na zewnątrz), aby utrzymać stałą objętość. Jest to ważne dla wielu organizmów niższych, które rozwinęły skomplikowane mechanizmy regulacji objętości komórek i zwykle obejmuje nie tylko transport wody, ale także przepływ jonów (głównie Na+, K+ i Cl-) przez błony, aby odzyskać równowagę przed nadmiernym pęcznieniem lub kurczeniem się, gdy są one narażone na działanie płynów zewnętrznych o różnej osmolalności (np. od słonej wody morskiej do rozcieńczonej wody deszczowej). Podczas gdy te mechanizmy transportu jonów istnieją również u ssaków, większość regulacyjnych funkcji „homeostatycznych” w organizmach wyższych jest osiągana poprzez utrzymywanie stałego środowiska wewnętrznego, w którym przebywają nasze komórki – słynne „milieu intérieur” lub „morze wewnątrz” zdefiniowane przez Claude’a Bernarda. Jest to osiągane w dużej mierze przez działanie nerek, w koordynacji z mózgiem wyczuwającym objętość i stężenie osocza (osmolalność), a następnie reagującym poprzez zwiększenie lub zmniejszenie ilości wody, którą uwalniają do moczu. Zostanie to omówione bardziej szczegółowo poniżej.

Oprócz utrzymywania objętości komórek, szybka wymiana wody przez komórki umożliwia tkankom i narządom wydzielanie i/lub wchłanianie wody jako część ich funkcji fizjologicznej. Komórki nabłonkowe wyściełające niektóre kanaliki nerkowe są szczególnie dobrze przystosowane do tej funkcji, ale komórki w innych układach narządów mogą również regulować transepitelialny ruch wody, aby umożliwić zachodzenie ważnych funkcjonalnie procesów. Na przykład, płyny wydzielane przez trzustkę, przewód żółciowy, gruczoły rzęskowe, ślinowe i sutkowe, jak również splot naczyniowy i nabłonek pigmentowy siatkówki, wszystkie wiążą się z szybkim przeznabłonkowym ruchem wody.

Jak woda przemieszcza się do i z komórek?

Wszystkie te procesy fizjologiczne wiążą się z ruchem wody przez błony komórkowe. Od dawna wiadomo, że kiedy większość komórek jest umieszczona w wodzie destylowanej, znacznie pęcznieją i mogą w końcu pęknąć. W przeciwieństwie do tego, gdy komórki zostaną umieszczone w roztworze soli, który jest bardziej stężony niż sole i inne składniki w ich cytoplazmie, będą się kurczyć. Proces ten jest w dużej mierze spowodowany osmotycznym przepływem wody, w górę lub w dół gradientu stężenia, co jest próbą wyrównania przez system stężenia osmotycznego po obu stronach błony plazmatycznej komórki. Ale jak dokładnie woda przemieszcza się przez błonę komórkową? Używając specjalnego urządzenia, które może mierzyć pęcznienie i kurczenie się czerwonych krwinek, modelu eksperymentalnego, który jest łatwy do uzyskania i manipulowania, badacze doszli do wniosku, że woda ma dwie drogi przemieszczania się przez błony. Kiedy osmotyczne pęcznienie i kurczenie się było monitorowane w różnych temperaturach, Solomon odkrył powolny, wrażliwy na temperaturę proces, na który nakładał się znacznie szybszy proces niezależny od temperatury (Rys. 1). Powolny proces odzwierciedlał dyfuzyjną przepuszczalność wody przez tłuszczową warstwę lipidową błony plazmatycznej – dyfuzja jest wrażliwa na temperaturę. Ale szybki proces był zgodny z obecnością wodnych porów w błonie, które pozwalały na szybsze, osmotycznie napędzane przejście wody, które nie wiązało się z dyfuzją (Rys. 1). Następnie Macey i Farmer oraz inni wykazali, że związek chlorek rtęci może znacząco hamować szybką składową tego procesu, co sugerowało obecność białkowych porów – lub kanałów wodnych – w obrębie błony. Chlorek rtęci wiąże się z grupami sulfhydrylowymi (resztami cysteiny) na białkach i hamuje ich funkcję: w tym przypadku przepuszczalność wody. Tak więc, te badania, które koncentrowały się na czerwonych krwinkach, wyraźnie zweryfikowały koncepcję, że pory wodne są odpowiedzialne za szybkie, niewrażliwe na temperaturę, osmotycznie napędzane przenikanie wody przez błony biologiczne. Jak zobaczymy, pory te zostały później zidentyfikowane jako akwaporyny.

Nerki regulują zawartość wody w naszym organizmie

Nerki to niezwykły organ, który jest najlepiej znany z „filtrowania” krwi w celu usunięcia produktów odpadowych, takich jak mocznik i inne toksyny, oraz z produkcji moczu. Około 180 litrów krwi jest filtrowane każdego dnia, jednak większość osób produkuje tylko około 1,5 litra moczu. Dokładna ilość zależy od tego, ile pijesz, jak gorąco jest i jak dużo ćwiczysz (co powoduje utratę wody przez pocenie się). Około 90% przefiltrowanego płynu jest usuwane w proksymalnych obszarach nerek i wartość ta jest dość stała u większości ludzi. Jednakże, pozostałe 10% (18 L) jest ponownie wchłaniane w kanaliku zbiorczym nerki pod wpływem hormonu antydiuretycznego, wazopresyny (VP). VP jest uwalniana przez tylną część przysadki mózgowej w odpowiedzi na odwodnienie (co powoduje wzrost stężenia osmotycznego surowicy) lub utratę objętości. Działa ona na komórki nabłonka kanalików zbiorczych nerek poprzez specyficzny receptor zwany receptorem wazopresyny (V2R) w celu pobudzenia reabsorpcji wody, co koryguje problem i przywraca stężenie i/lub objętość krwi do normalnego poziomu. Mechanizm, dzięki któremu VP powoduje ten pobór płynu przez nabłonek przewodu zbiorczego, jest obecnie dość dobrze poznany i obejmuje akwaporynowe kanały wodne.

Pęcherz moczowy ropuchy jako model nerki

Warto zrobić krok wstecz i przyjrzeć się, jak mechanizm działania VP był badany eksperymentalnie. Podczas gdy wpływ VP na czynność nerek był dobrze znany od jakiegoś czasu, szczegółowe rozbiórki jej działania komórkowego wymagały systemu modelowego, który był bardziej dostępny niż nerka. Praca z pojedynczymi kanalikami nerkowymi jest bardzo trudna (ale nie niemożliwa), ponieważ są one bardzo małe – mają tylko około 40 µm średnicy. Wielki przełom w badaniach nastąpił, gdy Bentley (i inni) odkrył, że pęcherz moczowy ropuchy również transportuje wodę w odpowiedzi na hormon antydiuretyczny. Jest to naturalna część ich procesu przetrwania w środowisku naturalnym. Po zanurzeniu w wodzie, ropucha wchłania wodę przez skórę i produkuje dużo bardzo rozcieńczonego moczu, który przechowuje w dużym, balonopodobnym pęcherzu. Kiedy ropucha ma ograniczony dostęp do wody w stawie i zaczyna się odwadniać, uwalniany jest jej własny hormon antydiuretyczny (zwany wazotocyną, analog VP), który powoduje, że nabłonek pęcherza staje się przepuszczalny dla wody. W ten sposób woda przechowywana w pęcherzu jest zwracana do krwi, aby nawodnić stworzenie. W istocie, ropucha nosi swoją własną butelkowaną wodę w pęcherzu. Pęcherz moczowy ropuchy stał się w ten sposób szeroko stosowany surogat do badania i zrozumienia VP indukowanego przepływu wody przez nabłonek kanalików zbiorczych nerek .

Przez wiele lat pęcherz moczowy ropuchy był używany do badania początku i przesunięcia działania VP na przepływ wody przez komórki nabłonkowe. Zidentyfikowano wiele komórkowych szlaków sygnałowych, które regulują ten proces w dół od interakcji VP-receptor. Jednym z najbardziej intrygujących ustaleń, które wyłoniły się z wielu badań pęcherza ropuchy była koncepcja kanałów wodnych wprowadzanych do błony plazmatycznej tych komórek nabłonkowych w celu zwiększenia przepuszczalności błony, a tym samym wody nabłonkowej. Po wycofaniu hormonu, te „kanały wodne” będą następnie usunięte z błony plazmatycznej przez internalizację do komórki (proces znany jako endocytoza), który przywrócił membranę do stanu nieprzepuszczalnego i zapobiegał przepływowi wody. Pomysł ten został opublikowany przez Wade’a, który ukuł termin „hipoteza wahadłowca”, aby opisać ruch kanałów wodnych tam i z powrotem do i z powierzchni komórki przez analogię do promu kosmicznego NASA. Ale natura tych kanałów wodnych pozostawała nieznana.

Odkrycie kanałów wodnych akwaporyny

Pomimo wielu prób zidentyfikowania białka, które tworzyło kanały wodne, pole to było zasadniczo zamrożone w czasie przez wiele lat. Wszystkie próby wyizolowania tego białka z oczyszczonych błon erytrocytów z pęcherzy pławnych ropuchy i nerki kończyły się ograniczonym sukcesem, choć niektóre publikacje zbliżały się do tego celu, a inne dostarczały ważnych informacji, np. o wielkości cząsteczki (ok. 30 kD). I tak się stało, że grupa Agre, badając białka czynnika Rhesus w błonach czerwonych krwinek, zauważyła na swoich żelach stałe „zanieczyszczające” pasmo o wielkości około 28 kD. Nie chcąc odrzucać tej informacji, dokopali się nieco głębiej i doszli do wniosku, że może to być poszukiwany kanał wodny w czerwonych krwinkach. Wyizolowano go i oczyszczono, a przeciwciała wykazały, że ulega on ekspresji również w komórkach kanalików proksymalnych nerek i cienkiej zstępującej kończyny Henlego – oba te kanały są konstytutywnie wysoce przepuszczalne dla wody. Czy to może być kanał wodny? Decydujący moment nastąpił, gdy grupa Agre wstrzyknęła mRNA kodujące to białko do systemu ekspresji in vitro, oocytów Xenopus. Błona oocytu jest normalnie bardzo nieprzepuszczalna dla wody – jaja są składane do słodkiej wody i pękłyby, gdyby błona była przepuszczalna! Ale po wstrzyknięciu mRNA kodującego domniemany kanał wodny, oocyty zrzucone do wody destylowanej zrobiły dokładnie to – pękły, podczas gdy oocyty kontrolne pozostały nienaruszone. Grupa Agre’a zdała sobie sprawę, że wstrzyknięte mRNA zmusiło oocyty do wyprodukowania nowego białka, które po przeniesieniu do błony oocytu przez mechanizmy transportu komórkowego spowodowało, że błona stała się wysoce przepuszczalna dla wody. Nastąpiło wielkie świętowanie. Seria kolejnych prac potwierdziła, że to nowe białko, nazwane CHIP28 (channel-forming integral membrane protein of 28 kD), było pierwszym kanałem wodnym, który został ostatecznie zidentyfikowany.

Rodzina akwaporyn

Wkrótce po tym, jak molekularna tożsamość CHIP28 stała się znana, inni znaleźli serię homologicznych białek, które utworzyły nową rodzinę. Stały się one znane jako akwaporyny. W czasie, gdy nazwa ta została po raz pierwszy użyta, istniały 4 znane akwaporyny u ssaków – AQP1, 2, 3 i 4. Obecnie istnieje 13 akwaporyn u ssaków, a setki z nich zostały zidentyfikowane u innych organizmów, w tym u roślin. Wszystkie one mają te same ogólne cechy strukturalne, o masie cząsteczkowej około 30 kD w formie nie glikozylowanej i kilka różnych stanów glikozylacji, które skutkują wyższą masą cząsteczkową. Wszystkie akwaporyny mają 6 domen transmembranowych; C- i N-końce znajdują się w cytoplazmie; tworzą funkcjonalny tetramer w dwuwarstwie lipidowej, a struktura porów wodnych wewnątrz białka została wyjaśniona za pomocą krystalografii rentgenowskiej dla niektórych akwaporyn. Nieoczekiwanie, niektóre akwaporyny są bardziej przepuszczalne dla wody niż inne, a niektóre mogą transportować inne cząsteczki oprócz wody. Na przykład, AQP3 jest przepuszczalna dla glicerolu, a AQP9 jest przepuszczalna dla mocznika. Ponadto, niektóre akwaporyny są przepuszczalne dla gazów, takich jak CO2 i NO . Tak więc, dziedzina biologii akwaporyn stale się rozwija, a doniesienia o nowych i nieoczekiwanych funkcjach w różnych komórkach i tkankach pojawiają się regularnie.

Aquaporin 1 and 2 (the VP Sensitive Water Channel) in the Kidney

AQP1, the red cell water channel, is highly expressed in proximal tubules and thin descending limbs of Henle, both of which are highly permeable to water at all times . Te segmenty kanalików są zaangażowane w reabsorpcję 90% przefiltrowanej wody. Druga akwaporyna, AQP2, została zidentyfikowana w komórkach głównych kanalika zbiorczego nerki. Są to komórki, które (podobnie jak pęcherz pławny ropuchy) zmieniają swoją przepuszczalność wody w odpowiedzi na hormon antydiuretyczny, VP, i w ten sposób regulują reabsorpcję pozostałego płynu – prawie 20 L dziennie. AQP2 jest kanałem wodnym regulowanym przez VP. W obecności VP, AQP2 gromadzi się na powierzchni komórek głównych, a woda przemierza nabłonek pod wpływem gradientu osmotycznego (ryc. 2). Bazolateralny aspekt tych kanalików jest hipertoniczny w stosunku do płynu w ¶wietle kanalika i w obecno¶ci VP woda spływa w dół wzdłuż tego gradientu. Błona podstawna komórek głównych jest zawsze przepuszczalna dla wody ze względu na obecność AQP3 lub AQP4 w różnych częściach nerki. Zatem ilość AQP2 w błonie apikalnej jest czynnikiem limitującym tempo reabsorpcji wody w kanaliku zbiorczym nerki. Wieloletnie badania wykazały, że AQP2 podlega recyklingowi pomiędzy błoną plazmatyczną a pęcherzykami cytoplazmatycznymi w komórkach głównych, a VP zmienia równowagę w taki sposób, że więcej AQP2 gromadzi się na powierzchni komórki, a mniej w jej wnętrzu, co odpowiada za wzrost przepuszczalności błony (ryc. 2). Biologia komórkowa leżąca u podstaw tego procesu jest częściowo zrozumiała i obejmuje kaskadę sygnalizacyjną, która jest inicjowana przez interakcję VP z receptorem, aktywację cyklazy adenylowej w celu zwiększenia wewnątrzkomórkowego cAMP, aktywację kinazy białkowej A i fosforylację białka AQP2. Fosforylacja jest krytycznym wydarzeniem, które powoduje błonową akumulację AQP2, a kilka laboratoriów jest zaangażowanych w badania mające na celu dalsze zrozumienie tego procesu. Zainteresowanego czytelnika odsyłamy do ostatnich szczegółowych przeglądów dotyczących tego procesu .

Patofizjologia akwaporyn

Jak można się spodziewać, akwaporyny zostały włączone do wielu chorób, przede wszystkim nerek (ryc. 3). Wadliwe działanie lub mutacje AQP2 lub, częściej, V2R, powodują cukrzycę nefrogenną (NDI), w której pacjenci nie są w stanie zagęścić moczu i teoretycznie mogliby oddawać do 18 litrów rozcieńczonego moczu dziennie, czyli ilość normalnie wchłanianą w przewodzie zbiorczym. Ze względu na inne mechanizmy kompensacyjne, większość pacjentów z NDI produkuje od 5 do 10 litrów moczu dziennie. Dostępne terapie mogą tylko częściowo złagodzić objawy, a znalezienie lepszych leków wymaga więcej pracy. Najczęstszą przyczyną NDI są pacjenci otrzymujący leczenie litem z powodu zaburzeń dwubiegunowych. Lit powoduje ciężką downregulation genu AQP2 z powodów, które nie są całkowicie zrozumiałe . Chociaż jest to bardzo skuteczna terapia zaburzeń dwubiegunowych, ten i inne efekty uboczne sprawiają, że wielu pacjentów niechętnie podejmuje się leczenia litem. Inne zaburzenia związane z AQP, głównie zidentyfikowane w znokautowanych modelach zwierzęcych, to defekt zagęszczania moczu (zidentyfikowano ludzi z AQP1), zaćma (AQP0), udar mózgu (AQP4) i krucha skóra spowodowana wadliwym nawilżaniem (AQP3). AQP1 i AQP2 są również zaangażowane w migrację komórek i gojenie się ran. Wreszcie, atrakcyjność akwaporyn przyciągnęła wyobraźnię agencji reklamowych zaangażowanych, na przykład, w przemysł kosmetyczny. Google it and see!

Przyszłe kierunki

Jednym z ekscytujących obszarów biologii akwaporyn jest pojawienie się tzw. funkcji księżycowych tych białek kanałowych. Mogą one być związane z ich funkcją kanałową, jak w przypadku przepuszczalności gazu AQP1, lub niezwiązane z aktywnością kanałową, jak w przypadku AQP2, która jest zaangażowana w rozwój nerek poprzez jej interakcję z integrynami i macierzą zewnątrzkomórkową. Przyszłe badania z pewnością ujawnią więcej nieoczekiwanych właściwości akwaporyn. Duża liczba akwaporyn występuje u „niższych” gatunków ssaków, takich jak rośliny, mikroby i grzyby. Otwiera to drogę do wykorzystania tych informacji do poprawy wzrostu i adaptacji roślin poprzez stymulację funkcji AQP oraz do zwalczania infekcji mikrobiologicznych i grzybiczych poprzez hamowanie akwaporyn. Takie specyficzne inhibitory nie są jeszcze dostępne, ale jeśli i kiedy zostaną opracowane, mogą odegrać ważną rolę w medycynie jako akwaporyny (w leczeniu nadciśnienia), a być może także w leczeniu nowotworów (w celu blokowania przerzutów). Mamy również wiele do nauczenia się na temat biologii komórki związanej z handlem akwaporynami. W jaki sposób są one przemieszczane w komórce? Jak oddziałują z innymi białkami? Czy można zidentyfikować alternatywne szlaki sygnalizacyjne i wykorzystać je do ominięcia wadliwej sygnalizacji V2R w NDI? Ta praca jest w toku i obiecuje ujawnić tajemnice komórkowe, które odnoszą się nie tylko do biologii AQP, ale także do innych ważnych wydarzeń związanych z handlem komórkowym, które są implikowane w wielu innych chorobach człowieka.

Podziękowania/Oświadczenie o ujawnieniu

D.B. i jego koledzy w MGH Program in Membrane Biology otrzymali stałe wsparcie dla pracy nad akwaporynami od National Institutes of Health, obecnie numer grantu DK096586. D.B. otrzymał od Danone Research zwrot kosztów podróży i opłatę rejestracyjną za udział w Konferencji Naukowej H4H.

Author Contacts

Article / Publication Details