Tc99m-sestamibi jest szybciej absorbowany przez nadczynność przytarczyc niż przez normalne przytarczyce. Jest to zależne od kilku cech histologicznych w obrębie samej nieprawidłowej przytarczycy. Obrazowanie sestamibi jest skorelowane z liczbą i aktywnością mitochondriów w obrębie komórek przytarczyc, tak że oksyfilowe komórki gruczolaków przytarczyc mają bardzo wysoką awidność do sestamibi, podczas gdy wole komórki gruczolaków przytarczyc prawie w ogóle nie mają jakości obrazowania z sestamibi. Niektórzy badacze podjęli również próbę ilościowego określenia lub scharakteryzowania możliwości obrazowania gruczolaków przytarczyc na podstawie ekspresji genu MDR. Około 60 procent gruczolaków przytarczyc może być obrazowanych przez skanowanie sestamibi. Naturalny rozkład przyczyn pierwotnej nadczynności przytarczyc to w przybliżeniu 85% samotnych gruczolaków, 10-15% rozproszonej hiperplazji i 1% raka.
Obrazy nie są tak wiarygodne u pacjentów z wielogruczołową chorobą przytarczyc. Ponadto, ograniczenie wielkości nieprawidłowego gruczołu może ograniczać wykrywalność za pomocą skanowania radionuklidowego. Obrazowanie SPECT (trójwymiarowe), jako uzupełnienie metod planarnych, może zwiększyć czułość i dokładność, zwłaszcza w przypadku małych gruczolaków przytarczyc. Wykorzystując gamma kamerę w medycynie nuklearnej, radiolog jest w stanie określić, czy jedna z czterech przytarczyc jest nadczynna, jeśli jest to przyczyną nadczynności przytarczyc. Teoretycznie, nadczynność przytarczyc pochłonie więcej Tc99m-sestamibi i będzie jaśniejsza niż inne prawidłowe przytarczyce na zdjęciach z kamery gamma, szczególnie ze względu na wewnętrzną pętlę sprzężenia zwrotnego w organizmie, w której wapń z natury rzeczy wraca do receptorów wapnia i hamuje produkcję hormonu przytarczyc w prawidłowych przytarczycach. Czasami takie oznaczenie musi być wykonane trzy lub cztery godziny później, kiedy aktywność tarczycy i prawidłowych przytarczyc zanika; nieprawidłowa przytarczyca zachowuje swoją aktywność, podczas gdy radiofarmaceutyk jest wymywany z prawidłowej tarczycy. U pacjentów z wolem guzkowym lub guzami czynnościowymi tarczycy możliwy jest zwiększony wychwyt środka sestamibi, co utrudnia lub myli lokalizację przytarczyc.
Najnowsze metody wykorzystujące ten sam znacznik sestamibi w bardziej zaawansowanych skanerach, takich jak urządzenia SPECT/CT, poprawiły lokalizację gruczolaków przytarczyc, zwłaszcza w lokalizacjach ektopowych.