PMC

TEXT

Streptokoki są najliczniejszymi mieszkańcami ludzkiej jamy ustnej (6, 24) i uzyskują częsty dostęp do krwiobiegu poprzez zmiany przyzębia lub otarcia jamy ustnej powstałe w wyniku rutynowych czynności (32). Może to prowadzić do poważnych chorób, w tym infekcyjnego zapalenia wsierdzia (IE) (28) i bakteriemii neutropenicznej (29). Taksonomia paciorkowców jamy ustnej od dawna jest źródłem nieporozumień (4, 9, 20, 22, 31). Sekwencjonowanie genu 16S rRNA w znacznym stopniu rozjaśniło sytuację (13); jednakże, metoda ta nie jest wystarczająco czuła, aby odróżnić niektóre blisko spokrewnione gatunki, w tym Streptococcus mitis i Streptococcus oralis (12), lub aby umożliwić typowanie szczepów lub analizę filogenetyczną w obrębie gatunku. Zbadano zatem geny charakteryzujące się większą zmiennością, w tym 16S-23S rRNA intergeniczny odstęp transkrybowany (ITS) (2), geny podstawowe kodujące białka (1, 5, 7, 10, 12, 14, 15, 19, 23) lub oba (17, 18). Nie osiągnięto jeszcze konsensusu co do tego, który gen (geny) najlepiej nadaje się do tych celów. Ponadto, chociaż poprzednie badania zidentyfikowały paciorkowce jamy ustnej z klinicznych posiewów krwi przy użyciu ostatecznych metod sekwencjonowania (12, 23, 30), żadne z nich nie przedstawiło szczegółowych informacji klinicznych na temat choroby podstawowej. Postanowiliśmy zrobić obie te rzeczy.

Hodowle krwi wykonane w szpitalu Virginia Commonwealth University Medical Center od maja 2003 do maja 2008 zostały wstępnie zidentyfikowane jako zawierające paciorkowce przez kliniczne laboratorium mikrobiologiczne. Skrypt komputerowy został użyty do wykluczenia gatunków nieoralnych. Aby uniknąć analizy zanieczyszczeń, płytki izolacyjne były wymagane tylko wtedy, gdy dwa lub więcej raportów pochodziło z oddzielnych hodowli tego samego pacjenta. Jedna kolonia z każdej dostępnej płytki izolacyjnej była hodowana w hodowli bulionowej i badana makroskopowo i mikroskopowo. Jeśli zaobserwowano jakiekolwiek różnice w oddzielnych hodowlach pochodzących od tego samego pacjenta, obie hodowle były zachowywane. W przeciwnym razie, pojedyncza hodowla od każdego pacjenta była kriokonserwowana, a podwielokrotności były pobierane do amplifikacji PCR.

W celu określenia tożsamości gatunkowej i pokrewieństwa filogenetycznego każdego izolatu, 16S-23S ITS był amplifikowany przy użyciu starterów 6R i 13BF opisanych wcześniej (2). Gdy nie uzyskano produktów z niektórych izolatów, zauważyliśmy, że ostatnie trzy nukleotydy startera 6R nie pokrywały się z sekwencjami 23S rRNA w GenBank z kilku interesujących nas gatunków. Dlatego skróciliśmy i uprościliśmy primer 6R, tworząc 6R-S, i skróciliśmy primer 13BF, aby dopasować jego temperaturę annealingu (patrz Tabela S1 w materiale dodatkowym). Podobna modyfikacja primera 6R została opisana niedawno (18). Używając tych starterów, uzyskano amplikony PCR ze wszystkich izolatów i przekazano je do analizy sekwencji kapilarnego DNA.

Większość sekwencji DNA zawierała kompletny ITS oraz fragmenty genów 16S i 23S rRNA, które były wyrównane z sekwencjami ITS szczepów typu dostępnymi w GenBank lub wyznaczonymi przez nas ze szczepów uzyskanych z American Type Culture Collection (ATCC). Stwierdziliśmy, że sekwencje flankujące 16S i 23S, choć nie zachowane w większości opublikowanych sekwencji, ułatwiały wyrównanie ITS. Rzeczywiście, opublikowano co najmniej cztery sekwencje szczepów typu (18), w których CTAAGG zlokalizowany 78 bp przed 3′ końcem genu 16S rRNA wydaje się być mylony z identyczną sekwencją heksanukleotydową zdefiniowaną wcześniej (2) jako początek ITS. Przycięte sekwencje ITS (2) zostały następnie porównane i wyrównane za pomocą oprogramowania MEGA 4 (25) w celu skonstruowania drzewa filogenetycznego typu neighbor-joining (ryc. 1).

Wcześniej sugerowano, że sama analiza ITS jest wystarczająca do identyfikacji gatunkowej paciorkowców jamy ustnej, w tym blisko spokrewnionych gatunków S. mitis i S. oralis. Sugerowano, że charakterystyczne dla S. oralis są konserwatywne delecje jednobazowe w dwóch miejscach i całkowita długość ITS wynosząca 246 bp, podczas gdy S. mitis jest pozbawiony delecji i posiada ITS o długości 248-249 bp (2, 3). W naszym badaniu znaleźliśmy izolaty obu gatunków, które posiadały obie delecje lub nie posiadały żadnej z nich, wraz z nakładającymi się długościami ITS. Tak więc izolaty S. oralis i S. mitis nie mogły być wiarygodnie rozróżnione na podstawie tych kryteriów. Inne badanie sugeruje, że analiza sekwencji ITS, choć niewystarczająca do rozróżnienia S. oralis i S. mitis, jest wystarczająca do identyfikacji wielu innych gatunków paciorkowców jamy ustnej, w tym należących do grupy anginosus (18). Jednakże znaleźliśmy jeden izolat gatunku S. intermedius z grupy anginosus (VMC38), którego nie można było sklasyfikować na podstawie ITS (patrz Tabela S1 w materiale dodatkowym).

Duża liczba izolatów, szczególnie dla S. mitis i Streptococcus constellatus, również posiadała identyczne sekwencje, co wykluczało analizę filogenetyczną. Identyczne sekwencje uzyskano również z pięciu par izolatów pochodzących od tych samych pacjentów (dane nie pokazane).

Ponieważ analiza ITS nie była wystarczająca dla naszych celów, zsekwencjonowaliśmy drugi wspólny cel – gen sodA, kodujący zależną od manganu dysmutazę ponadtlenkową (1, 5, 10, 12, 14, 19, 27). Pozwoliło to na wykluczenie kilku izolatów. Pary szczepów wymienione powyżej jako pochodzące od tych samych osób i posiadające identyczne sekwencje ITS posiadały również identyczne sekwencje sodA, co potwierdziło, że izolaty były identyczne i jeden izolat z każdej pary został odrzucony. Dwa izolaty zostały odrzucone z powodu oczywistej pomyłki w postępowaniu ze szczepem, a kolejny nie został zachowany, ponieważ sekwencje ITS i sodA wskazywały, że był to szczep Enterococcus faecalis. Drzewo filogenetyczne uzyskane z pozostałych izolatów przedstawiono na ryc. 1.

Do analizy filogenetycznej wyrównanie sodA było lepsze niż ITS. Jedynymi izolatami o identycznych sekwencjach sodA były dwa szczepy S. mitis i dwa szczepy Streptococcus vestibularis. Wyrównanie sodA było również bardziej przydatne do oznaczania gatunków. Wszystkie szczepy referencyjne były dobrze odseparowane od siebie w drzewie filogenetycznym. W rezultacie uzyskano tylko cztery niejednoznaczne przyporządkowania gatunkowe dla sodA, w porównaniu do 15 dla ITS (patrz Tabela S1 w materiale dodatkowym). W tych przypadkach, w których pojedyncze oznaczenie gatunku było zgodne zarówno z sekwencjami ITS, jak i sodA, zastosowano to oznaczenie. Tylko 3 z końcowych 58 izolatów klinicznych nie mogły być pewnie zidentyfikowane przy użyciu tej metody. Izolaty VMC1 i VMC43 wytworzyły sekwencje ITS, które były zbyt krótkie, aby być informatywne, pomimo wielokrotnych prób sekwencjonowania, a VMC58 był niespójnie identyfikowany przez sekwencje ITS i sodA (Ryc. 1; Tabela S1). Potwierdziliśmy tożsamość gatunkową tych izolatów, wykorzystując niedawno opublikowaną bazę danych zawierającą sekwencje siedmiu genów domowych pochodzących od 420 dobrze scharakteryzowanych szczepów paciorkowców, w tym sodA, pfl i pyk (1). Sekwencje genów pfl i/lub pyk wszystkich kwestionowanych szczepów zostały określone i wyrównane z sekwencjami w bazie danych eMLSA.net (http://www.emlsa.net/), podobnie jak istniejące sekwencje sodA. We wszystkich przypadkach przyporządkowania gatunkowe pfl i pyk były zgodne z przyporządkowaniami z sodA. Ponadto, wyrównanie sodA wskazało, że sekwencja VMC58, chociaż różni się od szczepu typu, należy do klastra 13 izolatów Streptococcus infantis w bazie danych (dane nie pokazane). Konsensus identyfikacji gatunkowej wszystkich izolatów włączonych do badania przedstawiono na Ryc. 1 oraz w Tabelach S1 i S2 w materiale dodatkowym.

Pomimo, że wyniki te sugerują, że sama analiza sodA jest wystarczająca do identyfikacji większości szczepów, zalecamy włączenie co najmniej jednego dodatkowego kodującego białko genu domowego dla wszystkich szczepów. Wiele paciorkowców jamy ustnej jest naturalnie kompetentnych, a przypadki nabycia obcych genów opiekuńczych, w tym sodA, zostały zgłoszone (1, 12). Nie było to widoczne w naszym badaniu, ale występowały przypadki chimerycznych sekwencji ITS (VMC38 i VMC50) i sodA (VMC33). Dwie ostatnie publikacje poszły dalej, każda z nich sugeruje sekwencjonowanie innego zestawu siedmiu genów housekeeping dla multilocus sequence typing (7) lub multilocus sequence analysis (1). Podejścia te opierają się na analizie większej liczby genów w celu zapewnienia zwiększonej rozdzielczości i zminimalizowania wpływu sporadycznych genów chimerycznych lub obcych (1, 7). Schematy te pozwalają również na bardziej wyrafinowane analizy filogenetyczne, niż jest to możliwe w przypadku tylko dwóch lub trzech genów. Sporadycznie doświadczaliśmy jednak trudności w amplifikacji i sekwencjonowaniu pfl i pyk oraz niewielkiego sukcesu z dwoma innymi zalecanymi genami, map i ppaC (1). W innym niedawnym badaniu odnotowano podobne trudności (27). Tak więc wybór dodatkowych genów może wymagać empirycznych testów, ale te zastosowane w analizie siedmiu genów powinny być zbadane w pierwszej kolejności, ponieważ duże zbiory sekwencji z dobrze scharakteryzowanych szczepów są dostępne do porównania (1, 7).

Według naszej wiedzy jest to tylko drugie doniesienie o izolacie z hodowli krwi Streptococcus australis (12) lub S. infantis (30). Jedyne inne skojarzenie tego ostatniego gatunku z jakąkolwiek chorobą pochodzi z dwóch doniesień o jego izolacji z plwociny dorosłych z mukowiscydozą (17, 26). Interesujące jest zatem, że dorosły z mukowiscydozą był źródłem naszego izolatu S. infantis, VMC58 (patrz Tabela S2 w materiale uzupełniającym).

Dane dotyczące wrażliwości na antybiotyki są zawarte w Tabeli S2 i są w dużej mierze zgodne z poprzednimi badaniami (8). Tabela S2 zawiera również dane kliniczne i demograficzne dla pacjentów źródłowych, kategoryzując je na podstawie głównej choroby podstawowej: choroby medycznej, nowotworu złośliwego, IE lub chirurgii / urazu. Wszystkie osoby z IE zostały zdiagnozowane klinicznie i wszystkie, z wyjątkiem przypadku VMC56 (Tabela S2), zostały sklasyfikowane jako „definitywne IE” według zmodyfikowanych kryteriów Duke’a (16). Jedyny wyjątek miał historię wcześniejszego IE i dożylnego stosowania narkotyków (IVDU), co w połączeniu z dodatnimi posiewami krwi spowodowałoby zakwalifikowanie do kategorii „możliwego IE”. Zbadano również dane dotyczące możliwych źródeł infekcji, w tym linii centralnych, endoskopii przewodu pokarmowego, zapalenia błony śluzowej jamy ustnej, warunków stomatologicznych i IVDU. IVDU stwierdzono u 9 z 13 pacjentów z IE i tylko u 1 innego pacjenta w badaniu (Tabela S2). Różnica ta była statystycznie istotna (P < 0,0001; dokładny test Fishera). Tak więc, chociaż to badanie koncentrowało się na gatunkach doustnych, IVDU było przytłaczającym czynnikiem ryzyka.

Nasza analiza filogenetyczna nie ujawniła statystycznie istotnych związków między jakimkolwiek konkretnym gatunkiem lub typem klonalnym a chorobą podstawową lub innymi parametrami klinicznymi, w tym liczbą białych krwinek, najwyższą temperaturą, rozmiarem wegetacji, zastawką dotkniętą chorobą lub śmiercią pacjenta. Jedno z wcześniejszych badań zawierało wystarczająco dużo informacji, aby zidentyfikować gatunki izolowane od pacjentów z neutropenią (12). Nasze wyniki były podobne, ponieważ 11 z 12 izolatów w tamtym badaniu i 9 z 10 w naszym (Tabela S2) było albo S. mitis albo blisko spokrewnionym S. oralis. W naszym badaniu te dwa gatunki, razem wzięte, były istotnie częściej niż 12 pozostałych gatunków łącznie izolowane od pacjentów z neutropenią (P = 0,004; dokładny test Fishera). Może to odzwierciedlać powszechne występowanie tych gatunków w jamie ustnej. Interesujące jest jednak, że trend ten nie przeniósł się na IE. Łącząc nasze dane z danymi z tego samego badania (12) dla neutropenii i IE, S. oralis i S. mitis zostały wyizolowane z 20 z 22 przypadków neutropenii i tylko z 15 z 27 przypadków IE, różnica ta była statystycznie istotna (P = 0,01; dokładny test Fishera). Podobnie jak w poprzednich badaniach (11, 12, 30), liczba próbek ograniczała naszą zdolność do pewnej oceny innych możliwych związków między gatunkami a poszczególnymi chorobami lub cechami klinicznymi. Jednak, łącząc ostateczną identyfikację gatunków z charakterystyką kliniczną i demograficzną dla każdego pacjenta źródłowego (Tabela S2), staraliśmy się, aby nasze wyniki nadawały się do metaanalizy lub innych badań wykorzystujących połączone dane.

.