Plaque Assay

Atest plaque może być używany do oczyszczania klonalnej populacji wirusa lub do określenia miana wirusa jako jednostek tworzących plaque na ml (pfu/ml), tak aby znane ilości wirusa mogły być użyte do infekowania komórek podczas kolejnych prac. W tym badaniu, monowarstwy komórek są zakażane niskim stosunkiem wirusa, tak że sporadyczne komórki ulegają zakażeniu. Nałożenie agarozy utrzymuje komórki w stanie stabilnym i ogranicza rozprzestrzenianie się wirusa. Kiedy każda zainfekowana komórka wytwarza wirusa i ostatecznie ulega rozpadowi, tylko bezpośrednio przylegające komórki zostają zainfekowane. Każda grupa zakażonych komórek nazywana jest płytką (plaque). Niezakażone komórki otaczają blaszki. Po kilku cyklach zakażenia zakażone komórki w centrum płytek zaczynają ulegać lizie, a zakażone komórki na obrzeżach pozostają otoczone przez niezakażone komórki. Zjawisko to powoduje, że światło przechodzące przez zainfekowane komórki załamuje się inaczej niż otaczające je niezainfekowane komórki, a blaszki można uwidocznić gołym okiem lub za pomocą mikroskopu świetlnego. Każda płytka reprezentuje pojedynczego wirusa. Dlatego klonalne populacje wirusa mogą być oczyszczane poprzez izolację pojedynczych płytek. Pojedyncze płytki uzyskane z różnych rozcieńczeń roztworu wirusa mogą być liczone w celu określenia miana wirusa (pfu/ml) dla danej transfekcji lub roztworu wirusa. Stan komórek i ich równomierne rozmieszczenie na powierzchni płytki do hodowli tkankowej jest ważne dla powodzenia analizy płytek. Komórki powinny być zdrowe, > 95% żywotne i w fazie logarytmicznej wzrostu w czasie przeprowadzania analizy. Komórki zbite, komórki, które nie są równomiernie rozmieszczone w odpowiednim zagęszczeniu (>70%) na płytce oraz komórki, które nie przylegają do płytek do hodowli tkankowych w ciągu 30 minut po posianiu są szkodliwe dla badania.

Wymagane materiały dodatkowe:

Plaque Assay Agarose, Cat. No. 554766
Grace’s Unsupplemented Insect Cell Medium
Fetal Bovine Serum
Tissue Culture Dish, 60 x 15 mm, BD Falcon™ Cat. No. 353802
Łaźnia wodna 42°C

Protokół

Określić liczbę potrzebnych płytek

Dla każdej ko-transfekcji lub zapasu wirusa (i kontroli pozytywnej) wykonać duplikaty seryjnych rozcieńczeń (10 -3, 10 -4, 10 -5, 10 -6 ). Oznakować każdą płytkę 60 mm opisem próbki i rozcieńczenia.

Płytka hodowlana z komórkami owadów

1. Nasiać 2.3 x 10 6 komórek Sf9 na każdą płytkę 60 mm. Delikatnie kołysz płytkami do przodu i do tyłu, a następnie na boki, aby równomiernie rozprowadzić komórki na powierzchni płytki. Nigdy nie należy wirować płytki, gdyż powoduje to nierównomierne rozmieszczenie komórek. Po posianiu płytek, pozwól komórkom przylegać przez 30 minut do godziny. W tym czasie przygotuj roztwór agaru i rozcieńczenia wirusów. Dokonać wizualizacji, za pomocą mikroskopu świetlnego, w celu potwierdzenia >70% konfluencji i równomiernego rozmieszczenia komórek.

Przygotowanie roztworu agarozy

Komórki na płytkach są pokrywane 1% roztworem agarozy w Grace’s Insect Cell Medium uzupełnionym 10% FBS.

1. Początkowo, wyrównać temperaturę łaźni wodnej do 42°C. Określić całkowitą objętość potrzebnego roztworu agaru: pomnożyć 4 ml/płytkę przez liczbę testów płytkowych. Z tej całkowitej objętości, jedną połowę będzie stanowiła autoklawowana dH 2 O + agaroza do uzyskania 2% roztworu, a drugą połowę będzie stanowiła pożywka dla owadów Grace’a uzupełniona 10% FBS. Aby określić ilość, w gramach, agarozy do testów płytkowych potrzebnej do uzyskania końcowego 1% roztworu agarozy, należy pomnożyć całkowitą objętość przez 0,01. (Na przykład, 10 płytek x 4 ml = 40 ml. 40 ml X 0,01 = 0,4 gm.)
2. Dodać odpowiednią ilość autoklawowanej dH 2 O do odpowiedniej wielkości sterylnej szklanej butelki. Następnie, powoli dodać obliczoną ilość agarozy, delikatnie mieszając, aby wymieszać dH 2 O i agarozę. Mieszaninę gotować w kuchence mikrofalowej do momentu zagotowania. Wyjąć butelkę i sprawdzić, czy w mieszaninie nie ma nierozpuszczonej agarozy. Jeśli jest obecna, kontynuować podgrzewanie. Powtarzać czynność aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy (UWAGA: mieszanina i towarzysząca jej para są bardzo gorące i mogą spowodować poparzenia. Stosować odpowiedni sprzęt ochronny/środki ostrożności). Po całkowitym rozpuszczeniu agarozy, luźno zakręcić butelkę i przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 42°C. Pozostawić mieszaninę do ostygnięcia do 42°C.
3. Otrzymać Grace’s Insect Media i dodać Fetal Bovine Serum do 10%. Przykład: na 100 ml pożywki Grace’s Insect Media, dodać 10 ml FBS. Umieścić mieszaninę Grace’s media + 10% FBS w łaźni wodnej o temperaturze 42°C.

Przygotować seryjne rozcieńczenia wirusów

1. Dla każdej ko-transfekcji, oznaczyć sześć 15 ml sterylnych probówek od 10 -1 do 10 -6 z odpowiednim opisem próbki. Dodać 2,7 ml pożywki TNM-FH do każdej probówki. Dodać 0,3 ml supernatantu z ko-transfekcji do pierwszej probówki, wymieszać (vortex). Wykonać seryjne rozcieńczenia przez przeniesienie 0,3 ml do kolejnego rozcieńczenia, używając za każdym razem świeżej pipety.

Infekować komórki jednowarstwowe

1. W tym momencie komórki miały wystarczająco dużo czasu, aby przylgnąć do powierzchni płytki. Sprawdzić kilka płytek pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić 70% konfluencję i równomierne rozmieszczenie komórek.
2. Pracując na zduplikowanych płytkach z każdym rozcieńczeniem, ostrożnie odessać media z komórek, używając sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 µl i stosując próżnię. Nie naruszyć arkusza komórek. Dodać 1 ml odpowiedniego rozcieńczenia wirusa do każdej z zduplikowanych płytek i delikatnie poruszać płytką w przód i w tył, a następnie na boki, aby równomiernie rozprowadzić wirusa. Powtórzyć z wszystkimi odpowiednimi płytkami i rozcieńczeniami.
3. Delikatnie kołysać płytkami w temperaturze pokojowej, w sterylnym kapturze co 15 minut przez 1 godzinę.

Nakładać zainfekowane komórki agarozą

1. Po 1 godzinie potwierdzić, że roztwór agarozy ma temperaturę 42°C. Roztwór powinien być na tyle ciepły, aby nadal był w stanie ciekłym, ale powinien być na tyle chłodny, aby można go było trzymać w ręku. Jeśli nie można wygodnie trzymać butelki, roztwór jest zbyt gorący i zabije komórki Sf9. Upewnij się, że pożywka dla owadów Grace’s Insect Media w 10% FBS ma temperaturę 42°C. Jeśli tak, dodać taką samą objętość do roztworu agarozy, aby uzyskać ostateczny roztwór agaru. Dobrze wymieszać końcowy roztwór agaru.
2. Gdy roztwór jest gotowy, umieścić w szklanej zlewce wypełnionej wodą z łaźni wodnej. Powinno to zapobiec zestaleniu się roztworu podczas pracy pod wyciągiem. Podczas procedury okresowo sprawdzaj temperaturę wody w zlewce. Jeśli zaczyna się ochładzać, zastąp ją ciepłą wodą z łaźni wodnej.
3. Pracując z jedną zduplikowaną parą naraz, ostrożnie odessać pożywkę z komórek za pomocą sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 µl i podciśnienia. Nie naruszyć arkusza komórek. Podczas aspiracji należy lekko przechylić płytkę i odessać supernatant z krawędzi płytki. Pozwoli to na optymalną aspirację bez naruszania arkusza komórkowego. Następnie, powoli dodać 4 ml roztworu agaru do każdej płytki i pozwolić agarowi zestalić się.
4. Po zestaleniu się agaru na wszystkich płytkach, ostrożnie umieścić płytki w czystej, hermetycznej komorze inkubacyjnej. Nawilżyć komorę przez umieszczenie sterylnej gazy i 10 ml sterylnej wody w 10 mm szalce hodowlanej na dolnej półce komory inkubacyjnej. Zamknąć komorę i umieścić w inkubatorze o temperaturze 27°C. Pozostawić płytki do inkubacji na 6 – 10 dni.
5. Płytki można uwidocznić, odwracając je na ciemnym tle i oświetlając silnym źródłem światła z boku płytki lub trzymając je pod kątem 45° do źródła światła. Ucząc się identyfikacji płytek, należy zakreślić markerem możliwe płytki. Używając mikroskopu świetlnego, obserwuj przy małej mocy, aby potwierdzić, że w trawniku komórek znajduje się obszar prześwitu. W celu ułatwienia wizualizacji płytek, nałożyć 3 ml 0,5% agarozy (przygotowanej zgodnie z wcześniejszym opisem) zawierającej 50 µg/ml czerwieni obojętnej. (Przygotować roztwór podstawowy czerwieni obojętnej (Sigma N7005) o stężeniu 1 mg/ml w wodzie lub PBS. Sterylizować przez filtr i przechowywać w temperaturze 4°C w ciemności). Pozostawić do stwardnienia i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 27°C. Czerwień obojętna zabarwi zdrowe komórki, a blaszki miażdżycowe pojawią się jako wyraźne obszary o średnicy około 0,5 – 3 mm na białym tle. Ponieważ czerwień obojętna jest ważnym barwnikiem, ważne jest, aby barwienie wykonać, gdy monowarstwa komórkowa jest zdrowa, tj. 4 do 7 dni po zakażeniu.

Oczyszczanie płytek z materiału wirusowego

Aby zapewnić właściwą izolację, najlepiej jest pobierać płytki z płytek zawierających mniej niż 50 płytek. Należy umieścić na płytkach kilka rozcieńczeń wirusa, aby zapewnić uzyskanie wystarczająco małej liczby płytek. Płytki mogą być pobierane przy użyciu sterylnych końcówek mikropipet (1,000 µl) lub rurek mikrokapilarnych.

Amplifikacja wirusa z pobranych płytek

1. Zaznaczyć płytkę pod płytką markerem. Używając sterylnej końcówki pipety, usunąć korek agarozowy bezpośrednio nad płytką. Pobrać w ten sposób od 10 do 100 płytek.
2. Umieścić każdy korek agarozowy w oddzielnej probówce mikrowirówki zawierającej 1 ml podłoża do hodowli tkankowych. Wyeliminować cząstki wirusa z agarozy przez obracanie probówki przez noc w temperaturze 4°C.
3. Dodać 200 µl każdej pobranej płytki do oddzielnych studzienek 12-studzienkowej płytki do hodowli tkankowej, posianej 2 x 10 5 komórkami na studzienkę w 1 ml świeżej pożywki TNM-FH. Inkubować płytki przez 3 dni w temperaturze 27°C.
4. Supernatant wirusa z tego roztworu wyjściowego z pierwszego pasażu można zebrać i odwirowywać przez 5 minut przy 1000 x g w temperaturze 4°C w celu usunięcia pozostałości. Przechowywać w temperaturze 4°C.
5. Nakłuć 100 mm płytkę do hodowli tkankowych 5 x 10 6 komórkami dla każdego izolatu płytki. Pozwolić komórkom przyłączyć się i zastąpić podłoże 10 ml świeżego podłoża TNM-FH.
6. Dodać 200 µl bulionu pass-one do płytki 100 mm i inkubować w 27°C przez 4 dni. Zachować pozostałe 800 µl bulionu pasaż-one w 4°C jako kopię zapasową.
7. Zebrać supernatant wirusowy i odwirować w celu usunięcia resztek. Określić miano tego roztworu z pasażu drugiego. Jeżeli miano pozostaje poniżej 2 x 10 8 pfu/ml, przejść do Amplifikacji Baculowirusa.

.