BIOPROCESS ENGINEERING
Evaluation of the microbial diversity of denitrifying bacteria in batch reactor
S. I. MaintinguerI,*; I. K. SakamotoII; M. A. T. AdornoII; M. B. A. VarescheII,*
ABSTRAKT
Zbiorowiska mikroorganizmów w przemysłowej instalacji osadu czynnego mogą przyczyniać się do procesu denitryfikacji, ale informacje na temat mikroorganizmów obecnych w reaktorach denitryfikacyjnych są nadal skąpe. Usuwanie nieorganicznych związków azotu może być osiągnięte poprzez dodanie źródeł węgla do biologicznego procesu denitryfikacji. Etanol jest ekonomicznie opłacalną alternatywą jako źródło węgla w krajach tropikalnych, takich jak Brazylia, gdzie na dużą skalę produkuje się go z trzciny cukrowej. W niniejszej pracy opisano udaną aplikację osadu czynnego z azotanem i etanolem w okresowym reaktorze beztlenowym. Proces trwał 61,5 h, z całkowitym zużyciem azotanu w 42,5 h, wytworzeniem azotynów (2,0 mg/L) i zużyciem etanolu (830,0 mg/L) w 23,5 h. Liczba komórek denitryfikacyjnych według najbardziej prawdopodobnej liczby na początku pracy była niższa niż na końcu, co potwierdza zdolność inokulum z osadu czynnego do procesu denitryfikacji. W próbkach z liczebności komórek zidentyfikowano Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Comamonas sp. oraz bakterie niehodowlane. Dlatego te gatunki mogą być zaangażowane w redukcję azotanów i zużycie etanolu w reaktorze okresowym.
Słowa kluczowe: Activated sludge system; Acidovorax; Acinetobacter; Nitrate; Ethanol.
INTRODUCTION
Microorganizmy zdolne do denitryfikacji są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie: glebie, osadach, wodach słodkich, morzu i systemach oczyszczania ścieków (Park & Yoo, 2009).
Wiele inokul z domowych i przemysłowych oczyszczalni ścieków może zawierać bakterie denitryfikacyjne, głównie w systemach osadu czynnego (Liu i in., 2006; Daniel i in., 2009), gdzie biologiczne usuwanie azotu zachodzi w celu promowania denitryfikacji, tj. w heterotroficznych warunkach anoksycznych, źródła węgla organicznego działają jako donory elektronów i redukują azotan do gazu azotowego (Canto i in., 2008). Obecność węgla organicznego i źródeł energii jest niezbędna do heterotroficznej denitryfikacji (Nava et al., 2010).
Większość bakterii denitryfikacyjnych zaliczana jest do Phylum Proteobacteria, włączając w to między innymi Acidovorax, Comamonas i Acinetobacter. Bakterie takie mogą być obecne w oczyszczaniu ścieków, szczególnie w systemach osadu czynnego, które są zdolne do tworzenia azotu cząsteczkowego z azotanu i egzogennego źródła węgla, takiego jak etanol. W całkowitej denitryfikacji, tj. przekształcaniu azotanu w gazowy azot pośredniczą gatunki bakterii, które normalnie wykorzystują tlen z powietrza jako źródło energii (oddychanie tlenowe), ale mają również zdolność wykorzystywania azotanu i azotynu zamiast tlenu (stan anoksyczny). Tak więc bakterie te mogą rosnąć w warunkach tlenowych przy braku azotanu lub w warunkach anoksycznych w obecności azotanu. Konwersja azotanu do azotu cząsteczkowego jest również znana jako oddychanie anoksyczne (Park & Yoo, 2009).
Wykorzystano szeroką gamę związków organicznych, takich jak metanol, etanol, glukoza, octan, asparaginian lub kwas mrówkowy i związki aromatyczne (Queiroz i in., 2011). Jednak większość opublikowanych badań dotyczących denitryfikacji wody pitnej dotyczy stosowania metanolu, etanolu i kwasu octowego (Park & Yoo, 2009). Etanol (Daniel i in., 2009), glukoza i octan są niektórymi z zewnętrznych donorów elektronów z powodzeniem wykorzystywanych do denitryfikacji. Szczególnie w Brazylii, etanol stanowi realną alternatywę (Gavazza dos Santos i in., 2004). Etanol jest produkowany na dużą skalę w Brazylii od 1975 r., w ramach Narodowego Programu Alkoholu (1975-1985). Brazylia produkuje prawie 2,6 x 108 ton trzciny cukrowej, która jest przetwarzana przez 324 cukrownie do produkcji cukru i etanolu (Borrero i in., 2003). Jest on obficie produkowany z trzciny cukrowej i zwykle kosztuje mniej niż inne dogodne źródła węgla. Niemniej jednak, potrzeba dodatkowych źródeł donorów elektronów dla procesu egzogenicznego zwiększa koszty operacyjne, stanowiąc prawdopodobnie wadę w stosowaniu innowacyjnych technologii opartych na procesach beztlenowych (Gavazza dos Santos i in, 2004).
Zależności stechiometryczne opisujące reakcję energetyczną bakterii (Park & Yoo, 2009) zapisano w następujący sposób, gdy etanol jest używany jako źródło węgla:
0,69 C2H5OH + NO3 + H+ → 0.14 C5H7NO2 +0.43 N2 + 0.67 CO2 + 2.07 H2O
Pomimo, że równanie to ukazuje stechiometryczną ilość etanolu wymaganą do dysymilacji azotanów, dodatkowy etanol jest wymagany do odtleniania i syntezy komórek. W praktyce, 25% do 30% wymaganego etanolu jest używane do syntezy komórek bakteryjnych. Gdy obecny jest rozpuszczony tlen, zapotrzebowanie na etanol jest odpowiednio wyższe. Dlatego powszechną wartością roboczą stosunku wagowego substratu do azotanu (C:N03) jest prawie 3 (Park & Yoo, 2009).
Jest tylko kilka wzmianek na temat reaktorów okresowych i procesu denitryfikacji. Konfiguracje te mogą być wykorzystane do badania wymagań żywieniowych (Maintinguer et al., 2008). Proces denitryfikacji przy użyciu złożonych węglowodanów jest oceniany w reaktorach okresowych, ponieważ cząstki organiczne obecne w tych systemach mogą utrudniać działanie w innych konfiguracjach, takich jak w przypadku skrobi (Iamamoto, 2006). Ponadto, biomasa pozostaje zatrzymana w reaktorze okresowym we wszystkich okresach operacyjnych, w porównaniu z reaktorami o przepływie ciągłym. Te fakty mogą przyczynić się do całkowitego zużycia azotanów zweryfikowanego w reaktorze okresowym (Etchebehere et al., 2001; Gavazza dos Santos et al., 2004).
Usuwanie azotanów za pomocą inokulum osadu czynnego było badane szczególnie w krajach o klimacie umiarkowanym. Istnieje niewiele raportów z badań nad usuwaniem azotanów i biologii molekularnej z inokulum osadu czynnego z krajów tropikalnych, takich jak Brazylia. W związku z tym, pierwszym celem naszej pracy była ocena procesu denitryfikacji z wykorzystaniem aktywnego osadu jako inokulum z krajów o klimacie tropikalnym. Drugim celem naszych badań było przeprowadzenie charakterystyki mikrobiologicznej inokulum w celu zidentyfikowania potencjalnych organizmów zaangażowanych w proces denitryfikacji.
Praca ta badała różnorodność mikrobiologiczną denitryfikacji w reaktorze okresowym zasilanym etanolem i azotanem przy użyciu technik biologii molekularnej i tradycyjnej metodologii mikrobiologii.
MATERIAŁ I METODY
Reaktor okresowy
Doświadczenie przeprowadzono z osadem z systemu osadu czynnego Oczyszczalni Ścieków w Volkswagen São Carlos (São Carlos SP – Brazylia).
Reaktory okresowe przygotowano w trzech egzemplarzach w kolbach Duran® o pojemności 2 L, gdzie 1 L stanowiło podłoże reakcyjne, 10% (v/v) inokulum (100 mL/L).
Reaktory poddano działaniu atmosfery N2 (99,99%) przez 20 min po rozprowadzeniu roztworów. Następnie zamykano je korkami z gumy butylowej, zawijano i przechowywano w temperaturze 25 ºC ± 1 ºC, z mieszaniem przy 120 obr/min przez 61,5 h.
Analiza fizykochemiczna i chromatograficzna
Całkowite lotne substancje stałe (TVS) i zużycie azotanów oznaczano zgodnie z APHA, 2005, spektrofotometrycznie. Analiza azotynów została przeprowadzona metodą wstrzyknięcia przepływowego (FIA APHA, 2005). Lotne kwasy tłuszczowe i alkohole oznaczano metodą chromatografii gazowej w aparacie GC-2010 firmy Shimadzu, wyposażonym w detektor płomieniowo-jonizacyjny, autosampler do headspace COMBI-PAL – AOC model 5000 i kolumnę HP-INNOWAX (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm grubości folii), wg Maintinguer i in, 2008).
Kwantyfikacja bakterii denitryfikacyjnych
Najbardziej prawdopodobną liczbę (MPN) bakterii denitryfikacyjnych przeprowadzono przy pięciokrotnym rozcieńczeniu na początku i na końcu pracy reaktora okresowego, według Tiedje (1982), dostosowanego do próbek ciekłych. Liczbę komórek metodą MPN wykonano po 15 dniach inkubacji, zgodnie z APHA, 2005. Skład podłoża hodowlanego oraz, stężenia azotanów i etanolu stosowane w oznaczeniach MPN były podobne jak w przypadku pracy w reaktorze wsadowym, o czym wspomniano wcześniej.
Biologia molekularna
Próbki do analizy 16S rRNA uzyskano z najwyższych dodatnich zliczeń rozcieńczeń (MPN) bakterii denitryfikacyjnych pod koniec badania z reaktorów wsadowych.
Całkowite genomowe DNA próbek uzyskano po lizie komórek za pomocą kulek szklanych (Sigma) i ekstrakcji fenolowo-chloroformowej zgodnie z wcześniejszym opisem Griffiths i wsp. (2000) zmodyfikowanym.
Amplifikację za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) przeprowadzono przy użyciu zestawu starterów domeny bakteryjnej dla genu 16S rRNA, 27 do przodu (5′-AGAGTT TGATCCTGCTCAG-3′) i 1100 do tyłu (5′-AGGTTGCGCTCGTTG-3′) (Lane, 1991). Amplifikację PCR (Thermo cycler Eppendorf AG – Hamburg 22,331) przeprowadzono z początkową denaturacją w 94 ºC przez 5 min, a następnie 30 cyklami denaturacji w 94 ºC przez 45 s, annealingu w 55 ºC przez 45 s, przedłużenia w 72 ºC przez 1,45 min i końcowego przedłużenia w 72 ºC przez 7 min i schłodzenia w 4 ºC.
Próbki produktów PCR (Polymerase Chain Reaction) (16S rRNA) klonowano do wektora plazmidowego pGEM (Promega Easy Vector System I) zgodnie ze specyfikacją producenta. Klony były losowo wybierane i amplifikowane metodą PCR. Sekwencjonowanie nukleotydów przeprowadzono na automatycznym sekwenatorze ABI 310 PRISM (Dye terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, USA) zgodnie z instrukcją producenta, stosując starter forward M13 (50-GTAAA CGA CGG CCA G-30) (Messing, 1983). Amplifikację PCR (Thermo cycler Eppendorf AG Hamburg 22, 331) przeprowadzono z początkową denaturacją w 94 ºC przez 2 min, a następnie 25 cyklami denaturacji w 94 ºC przez 1 min, annealingu w 55 ºC przez 1 min, przedłużenia w 72 ºC przez 1 min; oraz końcowego przedłużenia w 72 ºC przez 7 min i schłodzenia w 4 ºC.
Sekwencje nukleotydowe poddano obróbce i wyrównano je programem Seqman (pakiet Lasergene DNAstar) w celu usunięcia sygnałów z wektora i baz niskiej jakości. Wyrównane sekwencje określono za pomocą programu wyszukującego BLAST na stronie NCBI w porównaniu z sekwencjami organizmów z genem 16S rRNA reprezentowanymi w bazie Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) i Ribosomal Data Base Project (http://rdp.cme.smu.edu). Drzewo filogenetyczne skonstruowano metodą Neighbor-Joining (Saitou & Nei, 1987) przy użyciu programu MEGA w wersji 4.1 (Kumar i in., 2008). Analiza Bootstrap resampling dla 1000 replik została przeprowadzona w celu oszacowania pewności topologii drzew. Dodano znane sekwencje Aspergillus niger (FJ828924.1) i użyto go jako out-group.
WYNIKI I DYSKUSJA
Zazotan został całkowicie zużyty po 42,5 h pracy (Rysunek 1). Wytwarzanie azotynów zostało zredukowane (2,0 mg/L w 18,5 h) i nastąpiło w ciągu 23,5 h pracy. Po 13,5 h pracy zaobserwowano 1,06 g etanolu/L (zużycie 36%) przy stężeniu początkowym 1650 mg/L. Zużycie etanolu na koniec eksperymentu wyniosło 54% (0,77 g/L w ciągu 61,5 h). Wyniki te były zbliżone do uzyskanych przez Gusmão i wsp. (2006). Autorzy ci (op.cit.) zaobserwowali 98,9% zużycia azotanów w ciągu 14 h pracy, z oczyszczonymi komórkami osadu granulowanego z up-flow anaerobic sludge blanket (UASB) oczyszczającego ścieki z ubojni drobiu (DAKAR-Tietê SP Brazylia), z azotanami (350 N-NO3 mg/L), etanolem (377 mg/L) i benzenem (10 mg/L) jako źródłami węgla.
Metanol (197,78 mg/L) i n-butanol (23,50 mg/L) zostały wykryte na początku eksperymentu. Alkohole te (metanol i n-butanol) były prawdopodobnie obecne w inokulum. Stężenie tych alkoholi wykazywało niewielkie wahania do końca testu, co wskazuje, że nie były one zużywane w tych warunkach denitryfikacji (Rysunek 2).
Maksymalne wytwarzanie kwasu octowego wynosiło 16,7 mg/L po 61,5 h pracy. Wartości STV na początku i na końcu pracy reaktora okresowego wynosiły odpowiednio 5,14 g/L i 11,40 g/L, co wskazuje na wzrost biomasy o 122%. Wyniki te wykazały, że warunki operacyjne narzucone na reaktor okresowy korzystnie wpłynęły na rozwój i trwałość konsorcjum bakteryjnego w warunkach denitryfikacji.
W niniejszych badaniach obserwowano proces denitryfikacji, co zostało również opisane przez innych autorów stosujących różne konfiguracje reaktorów.
Callado & Foresti (2001) eksploatował reaktory beztlenowe zasilane syntetycznym substratem symulującym ścieki bytowe w celu usunięcia największej frakcji materii węglowej oraz promowania nitryfikacji substratu, denitryfikacji i biologicznego usuwania fosforanów w tym samym cyklu porcjowym, w sekwencyjnym reaktorze porcjowym beztlenowym/aerobowym/anaerobowym. Układ pracował przez 41 dni w 84 cyklach po 12 godzin, w temperaturze 28±1ºC. Autorzy (op.cit.) zaobserwowali, że denitryfikacja zachodziła w naprzemiennych warunkach tlenowych i anoksycznych w fazie reakcji. Oba te procesy zachodziły tylko wtedy, gdy na początku fazy anoksycznej dodawano octan sodu (500 mg/L).
Etchebehere i in. (2001) testowali octan (40 mmol/L) i glukozę (13 mmol/L) jako źródła węgla do denitryfikacji w beztlenowym reaktorze porcjowym z azotanem potasu (20 mmol/L) dla trzech różnych inokul: osad z reaktora anoksycznego (skala laboratoryjna) do usuwania węgla i azotu z odcieków ze składowiska odpadów sanitarnych; osad z reaktora metanogenicznego UASB przetwarzającego słód oraz osad z reaktora anoksycznego zasilanego octanem i azotanem. W trzech badanych próbkach osadów ściekowych, podobnie jak w niniejszej pracy, azotany zostały całkowicie zużyte. Autorzy (op.cit.) stwierdzili, że octan jest lepszym źródłem węgla niż glukoza.
Gavazza dos Santos i wsp. (2004) badali proces denitryfikacji prowadzony w reaktorach porcjowych zasilanych ściekami syntetycznymi symulującymi ścieki nitryfikowane z przydomowych oczyszczalni ścieków z wykorzystaniem trzech źródeł donorów elektronów: metanolu (53,3 mg/L), etanolu (38,3 mg/L) i metanu (oprócz ścieków syntetycznych). Autorzy (op.cit.) zaobserwowali, że najbardziej efektywnym donorem elektronów był etanol, który całkowicie usuwał azotyny i azotany, co zaobserwowano w niniejszej pracy.
Iamoto (2006) uzyskał usunięcie azotu większe niż 84% w sekwencyjnym reaktorze porcjowym zasilanym skrobią i amonem w warunkach naprzemiennie anoksycznych i aerobowych (cykle 2h/2h) oraz 2 mg O2/L dla następujących stężeń: 125 mg N-NH4/L i 0,95 g skrobi/L, 250 mg N-NH4/L i 1,9 g skrobi/L, 500 mg N-NH4/L i 3.8 g skrobi/L, z inokulum z systemu osadu czynnego ze stacji oczyszczania ścieków (Flores da Cunha Rio Claro SP Brazylia). Jako źródło węgla testowano również etanol (1.500 mg/L) wraz z 500 mg NH4-N/L. Autorzy (op.cit.) zaobserwowali, że usuwanie azotynów i azotanów było całkowite (100%), podobnie jak w niniejszej pracy, co świadczy o możliwości zastosowania etanolu w procesie denitryfikacji.
Liczby komórek denitryfikacyjnych wg MPN na początku pracy reaktora okresowego były niższe (1,1 x 1010 MPN/mL) niż na końcu pracy (1,2 x 1019 MPN/mL) (rys. 3). Wyniki te są wyższe niż te podawane w literaturze, opisane poniżej.
Etchebehere i wsp. (2001) policzyli komórki denitryfikacyjne według najbardziej prawdopodobnej liczby (MPN) w podłożu podstawowym uzupełnionym ekstraktem drożdżowym (0,5 g/L), octanem potasu (1,84 g/ L) i azotanem potasu (0,72 g/ L) i uzyskali 9,6 x 106 MPN/mL z osadem z reaktora anoksycznego systemu oczyszczania odcieków. Callado i Foresti (2001) zastosowali octan sodu jako źródło węgla w sekwencyjnym reaktorze porcjowym anaerobowym/ aerobowym/anaerobowym i stwierdzili więcej MPN bakterii denitryfikacyjnych na początku pracy (2,5 x 106 MPN/mL) niż na końcu (3,5 x 105 MPN/mL). Autorzy (op.cit.) stwierdzili, że spadek ten nie miał wpływu na proces denitryfikacji.
Iamamoto (2006) uzyskał ten sam rząd wielkości w MPN bakterii denitryfikacyjnych na końcu pracy sekwencyjnego reaktora porcjowego z 250 mg N-NO3/L (3.9 x 106 MPN/mL) i 500 mg N-NO3/L (1.1 x 106 MPN/mL), oba z dodatkiem skrobi (1,900 mg/L) jako źródła węgla i inokulum z osadu czynnego z oczyszczalni ścieków (Rio Claro SP – Brazylia).
Bakterie denitryfikacyjne były faworyzowane przez warunki odżywcze narzucone w reaktorze anoksycznym. Fakt ten potwierdził zdolność inokulum z osadu czynnego do procesu denitryfikacji.
Z analizowanej próbki uzyskano 50 klonów do klonowania i sekwencjonowania fragmentów genu 16S rRNA konsorcjum drobnoustrojów. Jednakże klony o wartościach mniejszych niż 180 nukleotydów nie zostały włączone do analizy filogenetycznej, ponieważ nie były wystarczające do porównania z bazą danych opisaną poniżej. Sekwencje z klonowania i sekwencjonowania uzyskano z próbki dodatniej MPN o najwyższym rozcieńczeniu (10-18) (Tabela 1).
Acinetobacter sp. zidentyfikowano z podobieństwem wynoszącym: 98% (klony 1, 8, 13, 15, 33, 43, 45, 52, 54, 62, 67, 83 oraz 2, 4, 18, 20, 23 i 27) i 99% (klony 6, 15, 16, 37 i 38). Jest to Gram-ujemna bakteria, niemotylna, oksydazo-ujemna, niefermentująca, w parach, należąca do azylu Proteobacteria, rodziny Moraxellaceae. Jest ważnym mikroorganizmem w glebie, gdzie może przyczyniać się do mineralizacji, np. związków aromatycznych (Geng i in., 2006). Wang i wsp. (2007) wyizolowali szczepy Acinetobacter w próbce z systemu osadu czynnego (Jizhuangzi Tianjin – Chiny). Szczep ten był zdolny do biodegradacji fenolu (1.1 g/L) przez wolne i unieruchomione komórki. Geng i wsp. (2006) wyizolowali bakterie degradujące fenol w próbce z systemu oczyszczania z osadem czynnym (Singapur). Testy biochemiczne wykazały, że mikroorganizmy te mogą rosnąć w obecności etanolu, glukozy, sacharozy i związków aromatycznych, takich jak toluen, fenol i benzoesan. Został on opisany jako nowy gatunek – Acinetobacter EDP3. Autorzy (op.cit.) stwierdzili, że gatunek ten może być wykorzystany do usuwania związków fenolowych lub do bioremediacji in situ fenolu w glebach. Cai i wsp. (2009) zidentyfikowali 58 opornych bakterii z gleby skażonej arsenem. Szczepy Acinetobacter, Agrobacterium, Arthrobacter, Comamonas, Rhodococcus, Pseudomonas i Stenotrophomonas zidentyfikowano w wysokich stężeniach (20 mM Ar/L). Szczepy Acinetobacter sp. zidentyfikowane w tej pracy rozwijały się w narzuconych warunkach operacyjnych i mogły przyczynić się do denitryfikacji.
Klony 24 i 26 były podobne do Comamonas sp. z podobieństwem wynoszącym odpowiednio 98% i 97%. Comamonas to Gram-ujemne bakterie należące do Proteobacteria Phylum, Comamonadaceae Family. Etchebehere i wsp. (2001) wyizolowali Gram-ujemne bakterie denitryfikacyjne z reaktora anoksycznego używanego do oczyszczania odcieków ze składowisk odpadów w Montevideo (Urugwaj). Wyizolowany gatunek wykazywał podobieństwo do Comamonas terrigena. Jednakże, mikroorganizm ten został uznany za nowy gatunek, nazwany Comamonas nitrativorans. Opisano go jako bakterię gram-ujemną, z ruchliwą flagą polarną, tlenową i chemoorganotroficzną. Gatunek ten rósł w etanolu, octanie i maślanie, azotanie, azotynie i może redukować azotan do N2.
Więc, gatunki Comamonas zidentyfikowane w tej pracy były obecne w inokulum osadu czynnego i mogły przyczynić się do denitryfikacji, która wystąpiła w testach.
Klony 25, 28, 34, 36, 42 i 65 były podobne do Acidovorax sp. z podobieństwem wynoszącym odpowiednio 99% i 97% (tab. 1). Acidovorax sp. należy do gromady Proteobacteria Phylum; jest łatwo spotykany w systemach osadu czynnego. Wiele gatunków Acidovorax pełni rolę mikroorganizmów regulujących procesy oczyszczania mikrobiologicznego w systemach osadu czynnego. Kilka gatunków Acidovorax jest wykorzystywanych w biodegradacji tworzyw sztucznych oraz w usuwaniu innych zanieczyszczeń organicznych, w tym nitrofenoli, nitrobenzenu i polichlorowanych bifenyli poprzez denitryfikację (www.cebl.autokland.ac.nz/ecogenomics/index.html). Khan i wsp. (2002) wyizolowali gatunki bakterii denitryfikacyjnych degradujących PHBV (poli-3-hydroksymaślan-co-3-hydroksywalerian) z trzech systemów osadu czynnego, stosowanych do oczyszczania ścieków komunalnych (Nagoya, Osaka i Toyohashi – Japonia). Analizowane 37 klonów wykazało podobieństwo do organizmów należących do klasy Betaproteobacteria. Większość klonów wykazywała podobieństwo do gatunku Acidovorax, co potwierdza udział tego gatunku w degradacji PHBV w warunkach denitryfikacji. Gentile i wsp. (2007) wyizolowali gatunki podobne do Acidovorax, Delftia acidovorans, Pseudomonas, Chryseobacterium i Achromobacter z reaktora denitryfikacyjnego pracującego z etanolem (40,0 g/L) i kwasem mlekowym (40,0 g/L) jako źródłami węgla; testowali donory elektronów oddzielnie, a jako źródło azotu zastosowali azotan (1,9 g NaNO3/L; 2,3 g KNO3/L). Autorzy (op. cit.) stwierdzili, że całkowita redukcja azotanów do N2 była przeprowadzana przez gatunki Acidovorax, natomiast Achromobacter sp. i Delftia acidovorans były odpowiedzialne za niepełną denitryfikację azotanów do azotynów. Zatem gatunki Acidovorax były obecne w próbkach analizowanych w niniejszej pracy i mogły brać udział w denitryfikacji, która zachodziła w reaktorze okresowym.
Zidentyfikowano niewyhodowane szczepy bakteryjne z rodziny Rhodocyclaceae z 98% podobieństwem (klon 9 – AY945917.1 oraz klony 46, 84 AY945905), co przedstawiono w tabeli 1. Przedstawiciele rodziny Rhodocyclaceae są Gram-ujemnymi bakteriami należącymi do klasy Betaproteobacteria. Są to denitryfikujące tlenowe prątki o wszechstronnych możliwościach metabolicznych. Większość gatunków żyje w siedliskach wodnych i oligotroficznych warunkach glebowych. Wiele z nich występuje w ściekach i odgrywa ważną rolę w biologicznej dekontaminacji takich miejsc (http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodocyclaceae). Liu i wsp. (2006), podawali do reaktora denitryfikacyjnego chinolinę (40 mg/L), toksyczną aminę stosowaną w produkcji barwników, pestycydów i paliw syntetycznych, glukozę (180 mg/L), azotan i fosforan potasu (C/N/P 150:30:1). Inokulum pochodziło z drugiego zbiornika sedymentacyjnego systemu oczyszczania ścieków w Industry Shanghai Coking & Chemical Factory (Wujing, Shanghai – Japonia). Usuwanie chinoliny wynosiło 90,2% po okresie pracy reaktora w stanie ustalonym (6 tygodni). Molekularne analizy biologiczne inokulum i z reaktora denitryfikacyjnego wykazały w obu próbach obecność niehodowlanych bakterii Thauera i Azoarcus. Według autorów procentowy udział klonów należących do bakterii Azoarcus i Thauera wynosił odpowiednio 74% w reaktorze denitryfikacyjnym i 4% w inokulum. Poznanie mikroorganizmów z próbek środowiskowych jest uzależnione od warunków laboratoryjnych z czystymi kulturami (Pace, 1997). Jednakże, mniej niż 1% bakterii z różnych ekosystemów jest znanych (Amann, 1995), lub około 99% nie zostało zbadanych i zidentyfikowanych. Dlatego też w niniejszej pracy spodziewaliśmy się uzyskać podobne sekwencje bakterii nieuprawianych.
Drzewo filogenetyczne uzyskane przy użyciu konsensusowych starterów domeny Bacteria w analizach biologii molekularnej eksperymentu zilustrowano na Rysunku 4.
Współczynniki podobieństwa pomiędzy poszczególnymi grupami mikroorganizmów wynosiły od 97% do 99% i wskazywały na obecność filogenetycznie spokrewnionych gatunków, w oparciu o częściowe sekwencje ewaluacyjne genu 16S rRNA. Znane sekwencje gatunków pochodziły z bazy danych NCBI z Aspergillus niger (FJ828924.1) jako sekwencją out-group.
Therefore, Acidovorax, Comamonas and Acinetobacter species identified in this study were present in the activated sludge system of Volkswagen São Carlos Motors and they could be involved in the nitrate reduction and ethanol consumption.
WNIOSKI
Potencjał inokulum z systemu osadu czynnego i wykorzystanie etanolu jako źródła węgla w procesie denitryfikacji zostały zademonstrowane w reaktorze okresowym.
Otrzymane w badaniach wartości MPN bakterii denitryfikacyjnych, w połączeniu z wynikami usuwania azotanów, wykazały, że w inokulum z układu osadu czynnego znajdowały się bakterie denitryfikacyjne, którym sprzyjały narzucone warunki żywieniowe.
Zidentyfikowane klony miały przynależność filogenetyczną w azylu Proteobacteria, klasie Alphaproteobacteria i Gamaproteobacteria, z Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Comamonas sp. oraz bakterie niehodowlane. These bacteria could be involved in the nitrate reduction and consumption of ethanol in anoxic batch reactor.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors gratefully acknowledge grants received from FAPESP and CNPq.
APHA, AWWA and WEF, Standard methods for the examination of water and wastewater. 22th Edition, American Public Health Association, Washington, DC (2005).
Iamoto, C. Y., Nitrogen removal in sequencing batch reactor with suspended biomass treating high ammonia concentration wastewater. PhD Thesis, University of São Paulo, Brazil, School of Engineering, University of São Carlos, Brazil (2006).
Messing, J., New M13 vectors for cloning. Methods in Enzymology, 101 20-78 (1983).
Pace, N. R., A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science, 276, 734-740 (1997).