Komórki macierzyste z płynu owodniowego i błony owodniowej: Marker Discovery

Abstract

Płyn owodniowy (AF) i błona owodniowa (AM) zostały ostatnio scharakteryzowane jako obiecujące źródła komórek macierzystych lub progenitorowych. Zawierają one nie tylko subpopulacje o cechach komórek macierzystych przypominających dorosłe komórki macierzyste, takie jak mezenchymalne komórki macierzyste, ale także wykazują pewne właściwości embrionalnych komórek macierzystych, takie jak (i) ekspresja markerów pluripotencji, (ii) wysoka ekspansja w warunkach in vitro, lub (iii) zdolność do różnicowania wielopoziomowego. Ostatnie wysiłki koncentrowały się na izolacji i szczegółowej charakterystyce tych typów komórek macierzystych. Jednakże, różnice w ich fenotypie, ich heterogenno¶ć opisywana przez różne grupy oraz brak jednego markera ekspresji wył±cznie w tych komórkach mog± uniemożliwić wyizolowanie czystej homogennej populacji komórek macierzystych z tych Ľródeł i potencjalne wykorzystanie tych komórek w zastosowaniach terapeutycznych. W tej pracy chcemy podsumować ostatnie postępy w odkrywaniu markerów dla komórek macierzystych pochodzących ze źródeł płodowych, takich jak AF i AM, przy użyciu nowych metodologii opartych na transkryptomice, proteomice lub analizach sekreomicznych.

1. Wprowadzenie

Zarówno płyn owodniowy (AF), jak i błona owodniowa (AM) stanowią bogate źródła komórek macierzystych, które w przyszłości mogą być wykorzystane do klinicznych zastosowań terapeutycznych. Obawy etyczne dotyczące izolacji komórek macierzystych z tych źródeł są zminimalizowane, w przeciwieństwie do problemów pojawiających się w badaniach nad ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi (ESC). AF jest pobierana podczas planowych amniopunkcji między 15 a 19 tygodniem ciąży w celu diagnostyki prenatalnej, a nadmiar próbki może być wykorzystany do pozyskiwania komórek, podczas gdy AM jest zwykle pobierana podczas cesarskiego cięcia w ciążach terminowych. Biorąc pod uwagę heterogeniczność populacji komórek macierzystych pochodzących z tych źródeł, izolacja specyficznych typów komórek jest trudna i wymaga szczegółowej fenotypowej i molekularnej charakterystyki odpowiednich komórek. Badania, które obejmują podejścia omiczne, mają fundamentalne znaczenie dla lepszego zrozumienia mechanizmów ekspresji molekularnej tych komórek i zdefiniowania prawidłowej metodologii ich izolacji, przed ich wykorzystaniem w podejściach terapeutycznych.

Praca ta ma na celu przedstawienie głównych cech biologicznych i molekularnych komórek macierzystych pochodzących z AF i AM, a także podkreślenie ostatnich postępów w odkrywaniu markerów przy użyciu globalnych metodologii, takich jak transkryptomika, proteomika czy analizy sekreomiczne.

1.1. Płyn owodniowy

AF służy jako płyn ochronny dla rozwijającego się embrionu, zapewniając wsparcie mechaniczne i wymagane składniki odżywcze podczas embriogenezy. Amniopunkcja jest stosowana od wielu dziesięcioleci jako rutynowa procedura kariotypowania płodu i diagnostyki prenatalnej, pozwalająca na wykrycie wielu chorób genetycznych.

Głównym składnikiem płynu owodniowego jest woda; jednakże jego ogólny skład zmienia się w czasie ciąży. Na początku ciąży osmolarność owodni jest podobna do osmolarności osocza płodowego. Po keratynizacji skóry płodu osmolarność owodni zmniejsza się w stosunku do osocza matki i płodu, głównie z powodu napływu moczu płodowego. Co ciekawsze, AF stanowi również bogate źródło populacji komórek macierzystych pochodzących zarówno z płodu, jak i z otaczającej go błony owodniowej. Dodatkowe badania prowadzone przez kilka grup koncentrowały się ostatnio na właściwościach komórkowych komórek pochodzących z owodni i ich potencjalnym zastosowaniu w modelach przedklinicznych i w terapiach transplantacyjnych .

1.1.1. Komórki macierzyste płynu owodniowego (AFSCs)

Komórki płynu owodniowego (AFCs) stanowią heterogenną populację wywodzącą się z trzech warstw zarodkowych. Komórki te mają wspólne pochodzenie nabłonkowe i wywodzą się albo z rozwijającego się zarodka albo z wewnętrznej powierzchni błony owodniowej, które są charakteryzowane jako komórki macierzyste błony owodniowej. AFC składają się głównie z trzech grup przylegających do siebie komórek, sklasyfikowanych na podstawie ich cech morfologicznych, wzrostu i biochemicznych. Komórki nabłonkowate (typu E) są prostopadłościennymi lub kolumnowymi komórkami pochodzącymi z płodowej skóry i moczu, komórki płynu owodniowego (typu AF) pochodzą z błon płodowych, a komórki fibroblastyczne (typu F) są generowane głównie z włóknistej tkanki łącznej. Zarówno komórki typu AF, jak i F mają morfologię fibroblastoidalną, a dominującym typem komórek wydaje się być typ AF, współekspresjonujący keratyny i wimentyny. Kilka badań udokumentowało, że ludzkie komórki macierzyste płynu owodniowego (AFSCs) mogą być łatwo uzyskane z niewielkiej ilości AF w drugim trymestrze ciąży, pobranej podczas rutynowej amniopunkcji, procedury, w której odsetek spontanicznych poronień wynosi od 0,06 do 0,5%. Do tej pory opisano wiele różnych protokołów hodowlanych prowadzących do uzyskania wzbogaconych populacji komórek macierzystych. Izolacja AFSC i odpowiednie protokoły hodowlane zostały podsumowane w ostatnim przeglądzie przez Klemmt et al. i mogą być sklasyfikowane w następujący sposób: (i) jednoetapowy protokół hodowli, w którym pierwotna hodowla była pozostawiona w stanie niezakłóconym przez 7 dni lub dłużej, aż do pojawienia się pierwszych kolonii , (ii) dwuetapowy protokół hodowli, w którym amniocyty, niepodłączone po 5 dniach w hodowli, były zbierane i dalej ekspandowane , (iii) selekcja markera powierzchni komórkowej dla CD117 (receptor c-kit) , (iv) mechaniczna izolacja początkowych kolonii mezenchymalnych komórek progenitorowych utworzonych w początkowych hodowlach , oraz (v) krótkoterminowe hodowle w celu izolacji kolonii fibroblastoidalnych . Większość AFSCs, wyizolowanych zgodnie z tymi metodami, posiadała multipotencjalny fenotyp mezenchymalny i wykazywała wyższy potencjał proliferacyjny oraz szerszy potencjał różnicowania w porównaniu z dorosłymi MSCs .

1.2. Amniotic Membrane (AM)

Błona owodniowa, pozbawiona tkanki naczyniowej, stanowi większość wewnętrznej warstwy błony płodowej i składa się z 3 warstw: (i) monowarstwy nabłonkowej składającej się z komórek nabłonkowych, (ii) acelularnej pośredniej warstwy podstawnej oraz (iii) zewnętrznej warstwy komórek mezenchymalnych, bogatej w mezenchymalne komórki macierzyste i umieszczonej w bliskim sąsiedztwie kosmówki . AM była stosowana w klinice przez wiele dekad do gojenia ran po oparzeniach, promowania tworzenia nabłonka i ochrony przed infekcjami. Ostatnio oceniano zastosowanie AM jako materiału do opatrywania ran w przypadku chirurgicznych ubytków błony śluzowej jamy ustnej, rekonstrukcji powierzchni oka, perforacji rogówki i powiększania pęcherza moczowego.

1.2.1. Amniotic Membrane Stem Cells (AMSCs)

Amniotic membrane stem cells (AMSCs) include two types, the amniotic epithelial cells (AECs) and the amniotic membrane mesenchymal stem cells (AM-MSCs) derived from the amniotic epithelial and the amniotic mesenchymal layers, respectively . Oba typy komórek powstają w fazie pregastrulacji rozwijającego się zarodka, przed wyodrębnieniem się trzech pierwotnych warstw zarodkowych i mają w większości charakter nabłonkowy. Do izolacji AECs i AM-MSCs opracowano wiele różnych protokołów, opartych głównie na mechanicznym oddzieleniu AM od błony kosmówki i późniejszym trawieniu enzymatycznym. AM-MSCs wykazywały plastyczną adhezję i morfologię fibroblastoidalną, podczas gdy AECs wykazywały fenotyp nabłonka brukowanego. AM-MSCs miały podobne cechy fenotypowe do tych pochodzących z dorosłych źródeł. Co ciekawsze, AM-MSCs, podobnie jak AF-MSCs, wykazywały wyższy wskaźnik proliferacji w porównaniu do MSCs pochodzących ze źródeł dorosłych oraz potencjał różnicowania wielostopniowego do komórek pochodzących z trzech warstw zarodkowych .

2. Immunofenotyp

2.1. Komórki macierzyste płynu owodniowego

Płyn owodniowy pojawił się ostatnio jako alternatywne płodowe źródło różnorodnych komórek pochodzenia macierzystego . W tym miejscu chcemy podsumować kluczowe markery, które charakteryzują AFSCs. Jak dotąd, MSCs reprezentują najlepiej scharakteryzowaną subpopulację AFSCs. AF-MSCs wykazywały typową ekspresję markerów mezenchymalnych, takich jak CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58 i CD44, ustaloną na podstawie analizy cytometrii przepływowej. Ponadto komórki te wyrażały antygeny HLA-ABC, podczas gdy ekspresja markerów hematopoetycznych CD34 i CD45, markera śródbłonka CD31 i antygenu HLA-DR nie została wykryta. Co ważniejsze, większość hodowanych AF-MSCs wyrażała markery pluripotencji, takie jak białko wiążące oktamer 3/4 (Oct-3/4), czynnik transkrypcyjny homebox Nanog (Nanog) i antygen embrionalny specyficzny dla danego etapu 4 (SSEA-4) .

Donoszono również, że kultury amniocytów zawierają niewielką populację CD117 (kinaza tyrozynowa specyficzna dla czynnika komórek macierzystych obecna głównie w ESCs i pierwotnych komórkach zarodkowych) pozytywnych komórek, które mogą być klonalnie rozszerzane w kulturze. Właściwości różnicowania CD117+ AFS zostały po raz pierwszy zbadane in vivo, potwierdzając w ten sposób ich tożsamość z komórkami macierzystymi. Eksperymentalne dowody sugerują, że AFSC pochodzą z wrzecionowatych komórek fibroblastoidalnych .

W próbie analizy subpopulacji AFSCs, nasza grupa ostatnio zidentyfikowała dwie morfologicznie odrębne populacje AFSCs pochodzenia mezenchymalnego, z różnymi właściwościami proliferacji i różnicowania, określane jako wrzecionowate (SS) i okrągłe (RS) . Obie subpopulacje wykazywały ekspresję markerów mezenchymalnych komórek macierzystych na podobnym poziomie. Jednakże zidentyfikowano, że kolonie SS wyrażały wyższy poziom antygenów CD90 i CD44 w porównaniu do kolonii RS .

2.2. Amniotic Membrane Stem Cells (AMSCs)

Szczegółowa analiza immunofenotypowa AMSCs ujawniła ekspresję antygenów, takich jak CD13, CD29, CD44, CD49e, CD54, CD73, CD90, CD105, , CD166, , marker stromalnych komórek macierzystych 1 (Stro-1), SSEA-3, SSEA-4, kolagen I i III (Col1/Col3), aktyna mięśni gładkich alfa (α-SMA), CD44, wimentyna (Vim), białko powierzchniowe fibroblastów (FSP) i antygen HLA-ABC . Natomiast cząsteczka adhezji międzykomórkowej 1 (ICAM-1) ulegała ekspresji na bardzo niskim poziomie, a białka TRA-1-60, białko adhezji komórek naczyniowych 1 (VCAM-1), czynnik von Willebranda (vWF), cząsteczka adhezji komórek śródbłonka płytek krwi (PECAM-1), CD3 i HLA-DR nie zostały wykryte. Jednym z najobficiej występujących białek w komórkach pochodzących z AM jest laminina, która odgrywa kluczową rolę w różnicowaniu, kształtowaniu i migracji komórek oraz regeneracji tkanek. Analiza RT-PCR wykazała ponadto, że AMSCs ulegały ekspresji genów, takich jak Oct-3/4, białko palca cynkowego 42 (zfp42 lub Rex-1), białko czynnika komórek macierzystych (SCF), cząsteczka adhezyjna komórek nerwowych (NCAM), nestyna (NES), białko morfogenetyczne kości 4 (BMP-4), białko wiążące GATA 4 (GATA-4) i czynnik jądrowy hepatocytów 4α (HNF-4α) nawet w wysokich pasażach. Transkrypty brachyury, czynnika wzrostu fibroblastów 5 (FGF5), sparowanego białka box (Pax-6) i białka morfogenetycznego kości 2 (BMP2) nie zostały wykryte. Podobnie, AECs były pozytywne dla CD10, CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC i negatywne dla ekspresji CD14, CD34, CD45, CD49d i HLA-DR, jak określono w analizach FACS. Dalsze badania wykazały, że AECs wykazywały ekspresję markerów komórek macierzystych, takich jak SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, region determinujący płeć Y-box 2 (Sox2), Tra1-60 i Tra1-80, czynnik wzrostu fibroblastów 4 (FGF4), Rex-1, białko kryptyczne (CFC-1) i prominina 1 (PROM-1) .

3. transkryptomika

3.1. Amniotic Fluid Stem Cells

Funkcjonalna analiza sygnatury ekspresji genów AF-MSCs w porównaniu ze szpikiem kostnym (BM-), krwią pępowinową (CB-) i AM-MSCs została pierwotnie przeprowadzona przez Tsai i wsp. Geny ulegające ekspresji w MSCs ze wszystkich trzech źródeł można było podzielić na grupy związane z (i) przebudową macierzy zewnątrzkomórkowej (CD44, kolagen II (COL2), insulinopodobny czynnik wzrostu 2 (IGF2), i tkankowy inhibitor metaloproteinazy 1 (TIMP1)), (ii) regulacja cytoszkieletu (aktywator plazminogenu typu urokinazowego (PLAU) i receptor (PLAUR)), (iii) regulacja chemokin i adhezja (alfa aktynina 1 (ACTN1), podjednostka 1B kompleksu białka związanego z aktyną (ARPC1B) i trombospondyna 1 (THBS1)), (iv) aktywacja plazminy (inhibitor szlaku czynnika tkankowego 2 (TFPI2)), (v) sygnalizacja receptora transformującego czynnika wzrostu β (TGFβ) (kaweolina 1 (Cav1), kaweolina 2 (Cav2), inhibitor kinazy zależnej od cyklin 1A (CDKN1A)) oraz (vi) geny kodujące ligazy ubikwitynowe E3 (SMURF). Wśród genów ulegających zwiększonej regulacji w AF-MSCs w porównaniu z BM-, CB- i AM-MSCs znalazły się cząsteczki zaangażowane w dojrzewanie i kurczliwość macicy, takie jak receptor oksytocynowy (OXTR) oraz regulujące syntezę prostaglandyn, takie jak fosfolipaza A2 (PLA2G10). Inne podwyższone geny w tej grupie były zaangażowane w transdukcję sygnału związaną z (i) odpowiedzią wyzwalaną trombiną ((F2R i F2RL)), (ii) sygnalizacją jeżową ((hedgehog acyltransferase (HHAT)) oraz (iii) szlakami związanymi z białkami G (białko wiążące GTP związane z rho (RHOF), regulator sygnalizacji białek G 5 i 7 (RGS5, RGS7) oraz fosfolipaza C beta 4 (PLCB4)).

W ostatnich badaniach nad AFSCs, Kim i wsp. po raz pierwszy opisali zmiany ekspresji genów w całkowitej populacji AFSC podczas różnych pasaży za pomocą analizy mikromacierzy illumina. Wykryto 1970 różnie wyrażonych genów i podzielono je na 9 odrębnych klastrów w zależności od ich profilu ekspresji. Do genów o stopniowo wzrastaj±cym poziomie ekspresji należały chemokina (C-X-C motif) ligand 12 (CXCL12), kadheryna 6 (CDH6) i receptor folianowy 3 (FOLR3). Genami ulegającymi downregulacji były m.in. cyklina D2 (CCND2), keratyna 8 (K8), IGF2, prekursor peptydu natriuretycznego (BNP) B oraz komórkowe białko wiążące kwas retinowy 2 (CRABPII). W celu uzyskania dalszych informacji przeprowadzono analizę danych chipowych dotyczących genów starzenia się, która wykazała wzrost transkryptów takich genów, jak czynnik wzrostu nerwów beta (NGFβ), substrat receptora insulinowego 2 (IRS-2), białko wiążące insulinopodobny czynnik wzrostu 3 (IGFBP-3) i apolipoproteina E (APOE). Ekspresja genów, takich jak PLAU, czynnik transkrypcyjny 1 E2F (E2F1), IGF2, gen podatności na raka piersi typu 1 (BRCA1), topoizomeraza DNA 2-alfa (TOP2A), antygen jądrowy komórek proliferujących (PCNA), forkhead box M1 (FOXM1), gen cykliny-A2 (CCNA2), budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta (BUB1B), i kinaza zależna od cykliny 1 (CDC2), był stopniowo zmniejszany podczas hodowli.

Wolfrum i wsp. przeprowadzili globalną analizę ekspresji genów AFSCs w porównaniu do iPSCs pochodzących z AF (AFiPSC) i ESCs . Wśród nich wyróżniono geny związane z samoodnową i pluripotencją (1299 genów, np. POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), Sox2, Nanog, białko wiążące mikroRNA LIN28) oraz specyficznością AFSCs (665 genów, np, OXTR, HHAT, RGS5, neurofibromatoza typu 2 (NF2), proteina (CD59), członek nadrodziny czynnika martwicy nowotworów 10 (TNFSF10), 5′-nukleotydaza (NT5E)) zostały wykryte w AFSCs. Ponadto, autorzy zbadali ekspresję genów związanych z senescencją i telomerami w AFSCs wczesnego i późniejszego pasażu, w celu zbadania wpływu przeprogramowania na ominięcie senescencji obserwowanej w hodowlach AFSCs. Sześćdziesiąt cztery geny zostały zidentyfikowane jako ulegające różnej ekspresji w AFSC w porównaniu do linii AFiPSC. Spośród nich, geny związane z telomerami oraz geny zaangażowane w regulację cyklu komórkowego, takie jak: mitotic arrest deficient-like 2 (MAD2L2), polimeraza poli ADP-rybozy 1 (PARP1), białko replikacyjne A3 (RPA3), dyskeratosis congenita 1 (DKC1), mutS homolog 6 (MSH6), CHK1 checkpoint homolog (CHEK1), kinaza polo-podobna 1 (PLK1), POU class 2 homeobox 1 (POU2F1), CDC2, gen zespołu Blooma RecQ helikaza-podobny (BLM), gen zespołu Wernera RecQ helikaza-podobny (WRN), metylotransferaza DNA 1 (DNMT1), metylotransferaza DNA 3 beta (DNMT3B), lamin B1 (LMNB1) i czynnik replikacji DNA 1 (CDT1), były obniżone w AFSCs w porównaniu do AFiPSCs i ESCs. Z kolei izomeraza peptydyl-prolil cis/trans (PIN1), lamin A/C (LMNA), czynnik zatrzymania wzrostu i indukcji uszkodzeń DNA alfa (GADD45A), chromobox homolog 6 (CBX6), oksydaza NADPH 4 (NOX4), endoglina (ENG), histon H2B typ 2-E (HIST2H2BE), CDKN1A, CDKN2A czynnik różnicowania wzrostu 15 (GDF15) i inhibitor proteazy serynowej 1 (SERPINE1), między innymi, były podwyższone w AFSCs w porównaniu do AFiPSCs i ESCs .

3.2. Amniotic Membrane Stem Cells

Analiza transkryptomiczna z wykorzystaniem mikromacierzy DNA została opisana dla AM-MSCs . Te dane eksperymentalne dostarczyły informacji na temat wzoru ekspresji genów AM-MSC w porównaniu z profilami ekspresji genów AF, CB i BM-MSCs. W AM-MSCs zidentyfikowano kilka genów zaangażowanych w regulację adaptacji immunologicznej pomiędzy interfejsem matczyno-łożyskowym. Między innymi stwierdzono wzrost ekspresji spondyny 2 (SPON2), białka indukowalnego interferonu alfa 27 (IFI27), receptora bradykininy B1 (BDKRB1), podrodziny B małych indukowalnych cytokin 5 i 6 (SCYB5, SCYB6) oraz homologu onkogenu związanego z wirusem mięsaka Yamaguchi (LYN). Ponadto, inne geny o zwiększonej ekspresji w AM-MSCs w porównaniu do AF, CB i BM-MSCs obejmowały (i) czynniki transkrypcyjne, takie jak forkhead box F1 (FOXF1), serce i neural crest derivatives expressed 2 (HAND2) i czynnik transkrypcyjny 21 (TCF21) oraz (ii) enzymy metaboliczne, takie jak dipeptydylo-peptydaza 6 (DPP6), tryptofan 2,3-dioksygenaza (TDO2) i sialyltransferazy (STs).

4. proteomika

4.1. Amniotic Fluid Stem Cells

Badania proteomiczne całkowitej populacji AFSC, w tym komórek epitelioidalnych (typu E), specyficznych dla płynu owodniowego (typu AF) i fibroblastycznych (typu F), ujawniły 2400 plamek, które doprowadziły do identyfikacji 432 różnych produktów genowych. Większość białek zlokalizowana była w cytoplazmie (33%), mitochondriach (16%) oraz jądrze (15%) i reprezentowała głównie enzymy (174 białka) oraz białka strukturalne (75 białek). Stosunkowo wysoki był również odsetek białek błonowych i związanych z błonami (7%). Spośród wykrytych białek 9 odpowiadało komórkom nabłonkowym, jak np. łańcuch D syntazy ATP (ATP5H), podjednostka 30 kDa oksydoreduktazy NADH-ubichinon (NUIM), aneksyna II (Anx2), aneksyna IV (Anx4), białko rybosomalne 40S SA (Rpsa), S-transferaza glutationowa P (GSTP), białko sklepienia głównego oraz cytokeratyny 19 i 7 (CK-19, CK-7), natomiast w fibroblastach odnotowano ekspresję 12 białek, w tym fibronektyny, tropomiozyny, transgeliny (TAGLN), podjednostki 34 kDa kompleksu arp2/3 (P34-arp), gelsoliny (Gsn), czynnika elongacji 1-β (EF-1β) i innych. Stwierdzono, że osiem białek ulega ekspresji w keratynocytach, w tym keratyny, rybonukleoproteiny, Anx2, acetylotransferaza aetylo-CoA (ACAT1) i inne, trzy ulegają ekspresji w naskórku, w tym tropomiozyny i keratyny, a jedno w komórkach mezenchymalnych (wimentyna 1 (Vim 1)).

Ostatnie badania dostarczyły dowodów na to, że różnorodność ekspresji enzymów metabolicznych w komórkach owodni jest zaangażowana w zespoły metaboliczne i genetyczne, a zatem ich wykrywanie może być ważne dla diagnostyki prenatalnej. Bardziej szczegółowa analiza mająca na celu określenie specyficznych enzymów metabolicznych obecnych w AFSCs została przedstawiona przez Oh i wsp. Zidentyfikowano dziewięćdziesiąt dziewięć białek, takich jak enzymy przenoszące węglowodany, enzymy przenoszące aminokwasy, białka metabolizmu puryn i enzymy metabolizmu pośredniego.

Analizę proteomiczną przeprowadzono również na różnych pasażach hodowli CD117+ AFSCs, wykazując różnice w ekspresji białek, które występowały głównie we wczesnych pasażach. Dwadzieścia trzy białka ulegały różnej ekspresji pomiędzy wczesnymi i późnymi pasażami, przy czym najbardziej przylegające białka ulegały redukcji: Col1, Col2, winkulina (Vcl), CRABP II, stathmina (STMN1) i kofilina-1 (CFL1). Z kolei TAGLN i Col3 są podwyższone podczas pasażu. Białka, które wykazały dysregulowane poziomy wzdłuż pasaży to podjednostka regulacyjna proteazy 26S 7 (PSMD7), izoenzym L1 ubikwitynowej hydrolazy terminala karboksylowego (UCH-L1), heterogenne jądrowe białko rybonukleinowe H (hnRNP H) i białko wiążące DNA TAR 43 (TDP-43) .

W 2007 roku, proteomiczna mapa ludzkich AF-MSCs została skonstruowana i bezpośrednio porównana z mapą pochodzącą z BM-MSCs . W AF-MSCs zidentyfikowano 261 różnych białek, przy czym większość z nich była zlokalizowana w cytoplazmie (41%), podczas gdy inne znajdowały się w retikulum endoplazmatycznym (8%), jądrze (13%), mitochondriach (12%), rybosomach (1%), cytoszkielecie (6%), cytoplazmie i jądrze (5%) oraz w białkach wydzielanych (2%). AF-MSCs wyrażały szereg białek związanych z proliferacją i utrzymaniem komórek, takich jak ubikwilina-1 (UBQLN1), która jest znana z kontroli progresji cyklu komórkowego i wzrostu komórek, białko związane z proliferacją 2G4 (PA2G4), białko regulujące wzrost jąder, białko wydzielane, kwaśne i bogate w cysteinę (SPARC), które jest regulowane podczas embriogenezy i jest zaangażowane w kontrolę cyklu komórkowego i adhezji komórek, oraz enhancer of rudimentary homolog (ERH), który również reguluje cykl komórkowy. TAGLN i galektyna 1 (Gal 1), oba obecne w komórkach macierzystych i związane z różnicowaniem, również ulegały obfitej ekspresji w AF-MSCs. Inne białka ulegające wysokiej ekspresji w AF-MSCs były związane z (i) rozwojem, takie jak Deltex-3-like (DTX3L), oraz (ii) organizacją i ruchem cytoszkieletu, takie jak CFL1, białko podobne do koktozyny (CLP) i homolog białka włączonego (Enah). Zgodnie z oczekiwaniami, Vim również ulegał ekspresji w dużych ilościach w AF-MSCs. W tym badaniu opisano również szczegółowe porównanie wspólnych zidentyfikowanych białek w komórkach AF i AF-MSCs .

W naszym późniejszym badaniu , ustaliliśmy mapę proteomiczną dwóch morfologicznie różnych typów mezenchymalnych progenitorowych komórek AF (SS i RS) przez 2-DE. Dwadzieścia pięć białek ulegało różnej ekspresji w tych dwóch subpopulacjach. Białka, których ekspresja była wyższa w SS-AF-MSCs w porównaniu z RS-AF-MSCs, to prekursor retikulokalbiny-3 (RCN3), kolagen α1 (I) (COL1α1), prekursor białka 9 wiążącego FK506 (FKBP9), inhibitor dysocjacji Rho GDP 1 (RhoGDI), białko chlorkowego kanału wewnątrzkomórkowego 4 (CLIC4), syntaza tryptofanylo-tRNA (TrpRS) i białko szoku cieplnego 70 kD (HSP70). Peroksiredoksyna 2 (Prdx2), białko szoku cieplnego 60 kD (HSP60), GSTP i Anx4 były podwyższone w RS-AFMPCs. Natomiast białka zidentyfikowane w RS-AF-MSCs obejmowały jedynie cytokeratynę-8, -18 i -19 (CK-8, -18 i CK-19), katepsynę B (CTSB), CLP i białko integryny αV (CD51). Białka związane z mezenchymą, takie jak Vim, Gal, Gsn i prohibityna (PHB), ulegały ekspresji na tym samym poziomie w obu populacjach .

4.2. Amniotic Membrane Stem Cells

Szczegółowe podejście do badania ludzkich białek AM zostało opisane przez Hopkinsona i wsp. W pracy tej autorzy przeprowadzili analizę proteomiczną próbek AM, które zostały przygotowane do przeszczepu u ludzi, przy użyciu żeli 2-DE. Zbadano również media do płukania próbek AM i zidentyfikowano wydzielane z nich białka. Białka wykryte zarówno w AM, jak i w popłuczynach sugerowały, że doszło do częściowego uwolnienia białek. Białka te były w większości rozpuszczalnymi białkami cytoplazmatycznymi i zostały sklasyfikowane zgodnie z ich subkomórkową lokalizacją i funkcją. Jednym z przykładów najbardziej obfitych i spójnych białek w AM jest THBS1, który według doniesień odgrywa rolę w naprawie ran, odpowiedzi zapalnej i angiogenezie. Mimekan (zwany również osteoglicyną/OGN) jest kolejnym białkiem wykrywanym w AM, które reprezentuje mały, bogaty w leucynę proteoglikan, występujący w ECM tkanki łącznej. Mimecan jest zgłaszane do utrzymania wytrzymałości na rozciąganie i hydratacji tkanki . Ponadto, większa forma mimekanu była wyrażana w komórkach AM i była podatna na rozszczepienie proteolityczne. Indukowane przez TGF-β białko ig-h3 (βIG-H3), cząsteczka adhezyjna ECM działająca jako czynnik wzrostu związany z błoną podczas różnicowania komórek i gojenia się ran, oraz intergrina α6 (CD49f), składnik integryny α6β4, były również obecne w znacznych ilościach w komórkach AM. Dobrze wiadomo, że interakcja α6β4-βIG-H3 odgrywa ważną rolę w pośredniczeniu w adhezji komórek i szlakach sygnałowych naprawy ran.

Inne ważne badanie przeprowadzone przez Baharvand i wsp. koncentrowało się na analizie ludzkich AM wysuszonych przez nabłonek, wykazując zarówno ilościowe, jak i jakościowe różnice w porównaniu z AM niepoddanymi obróbce. Zbadali proteom ludzkiego nabłonka AM, który był używany jako nisza limbicznych komórek macierzystych do leczenia rekonstrukcji powierzchni oka. We wszystkich żelach 2-DE wykryto 515 plamek, a 43 białka zostały zidentyfikowane przy użyciu MALDI TOF/TOF MS w AM. Najbardziej obfitymi białkami były różne izoformy lumikanu (LUM) i OGN, oba należące do rodziny proteoglikanów (PG). W szczególności, OGN może odgrywać rolę w wielu procesach biologicznych, w tym we wzroście komórek, angiogenezie i zapaleniu. Inne wykryte białka obejmowały kolagen VI α-1/α-2 (Col6a1/Col6a2), łańcuch beta fibrynogenu (FGB), izoformę A transglutaminazy 2 (TGM2A), wariant b-aktyny (ACTB), białko szoku cieplnego 5 (HSPA5) o masie 70 kD, nidogen 2 (NID2), CD49f, βIG-H3 i tubulointerstitial nephritis (TIN). Niektóre z białek zidentyfikowanych w tym badaniu były również związane z macierzą zewnątrzkomórkową (extracellular matrix – ECM). Wśród wykrytych, fibronektyna (FN), lamininy i kolagen IV (Col4) i VII zostały zgłoszone do promowania adhezji i migracji nabłonka .

5. Sekretom

Ostatnio dokonano znacznego postępu w analizie białek wydzielanych z AFSCs. Udokumentowano, że sekrecjom AFSC był odpowiedzialny za wzmocnienie waskulogenezy i był zdolny do wywołania silnej odpowiedzi angiogennej u biorców myszy. Według tego badania, szczegółowa analiza mediów kondycjonowanych przez AFSC ujawniła obecność znanych czynników proangiogennych i antyangiogennych przy użyciu technologii MAP firmy Luminex. Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), czynnik 1 pochodzący z komórek stromalnych (SDF-1), interleukina 8 (IL-8), białko chemotaktyczne monocytów 1 (MCP-1) oraz dwa inhibitory angiogenezy, interferon-gamma (IFNγ) i białko 10 indukowane interferonem gamma (IP-10), zostały zidentyfikowane jako wydzielane białka. Wykazano również, że stosunkowo niewielka liczba AFSC wystarcza do wydzielania wykrywalnej ilości proangiogennych czynników wzrostu i cytokin. Ich wydzielanie może być regulowane w sposób zależny od dawki w zależności od początkowej liczby użytych komórek .

Systematyczne badania nad białkami wydzielanymi przez AFSC doprowadziły do wniosku, że proangiogenne rozpuszczalne czynniki z AFSC mogą pośredniczyć w rekrutacji progenitorów śródbłonka w modelu niedokrwionego szczura . W szczególności, medium kondycjonowane pochodzące z AFSCs mogło miejscowo dostarczać angiogenne czynniki wzrostu i cytokiny do płata skóry w modelu niedokrwionego szczura i było odpowiedzialne za wyzwalanie endogennej naprawy poprzez rekrutację komórek progenitorowych śródbłonka .

W naszych ostatnich badaniach, zbadaliśmy potencjał terapeutyczny AF-MSCs i ich wydzielanych cząsteczek u myszy z ostrą niewydolnością wątroby . Różnorodne cytokiny i czynniki wzrostu zostały wykryte w medium kondycjonowanym AF-MSC. Wykryto cytokiny takie jak interleukina 10 (IL-10), interleukina 27 (IL-27), rodzina interleukin 17 (IL-17E), interleukina 12p70 (IL-12p70), interleukina-1 beta (IL-1β) i antagonista receptora interleukiny-1 (IL-1ra), odpowiedzialne za indukowanie lokalnej i ogólnoustrojowej redukcji mediatorów prozapalnych. Wydzielane były również SERPINE1, MCP-1 i SDF-1, odpowiedzialne za promowanie naprawy tkanek. Co ciekawe, wśród wysoko wyrażonych czynników wzrostu były: płytkowy czynnik wzrostu komórek śródbłonka (PD-ECGF), endostatyna/kolagen XVII (EN/Col17), moczowy aktywator plazminogenu (uPA), TIMP1, TIMP2, heparynowy czynnik wzrostu EGF-like (HB-EGF), czynnik wzrostu fibroblastów 7 (FGF7) i naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), odpowiedzialne za regenerację wątroby i naprawę tkanek.

6. Podsumowanie

Dotychczasowe dane sugerują, że płyn owodniowy i błona owodniowa mogą stanowić obiecujące źródła komórek macierzystych pochodzenia mezenchymalnego. Rzeczywiście, MSC są bardziej obfite i opisano szeroki zakres protokołów do ich izolacji. Jednakże, różne warunki hodowli tego samego typu komórek mogą wpływać na zróżnicowanie ich ekspresji genów, co stanowi ograniczenie dla ich izolacji i ekspansji in vitro. Badania obejmujące analizę fenotypową, z wykorzystaniem metodologii takich jak cytometria przepływowa i immunohistochemia, jak również transkryptomika, proteomika i analizy sekreomiczne, mają na celu określenie profilu białkowego tych komórek (Rycina 1). Oczekuje się, że dane wygenerowane przez takie badania pozwolą na wyjaśnienie ich zróżnicowanego repertuaru i potwierdzenie profilu molekularnego tych komórek macierzystych. Jednakże główną kwestią, którą należy się zająć jest izolacja homogenicznej populacji, która może ułatwić systematyczne badania w celu wyjaśnienia funkcji tych multipotencjalnych komórek.

Rycina 1

Podsumowanie najważniejszych markerów zidentyfikowanych w AFCs i AMCs dzięki zastosowaniu analiz transkryptomicznych, proteomicznych, sekreomicznych i immunofenotypowych. Białka zidentyfikowane w więcej niż jednym badaniu są zaznaczone pogrubioną czcionką.

Takie podejście może doprowadzić do identyfikacji kluczowych antygenów, które odzwierciedlają fenotyp tych komórek i wyjaśniają ich odrębne cechy. Tego typu badania otworzą drogę do systematycznej i wydajnej izolacji tych komórek przed ich zastosowaniem w warunkach klinicznych.

Dodatek

Pytania do dalszych badań

Jakie są odpowiednie metody izolacji i warunki hodowli AFSCs lub AMSCs, które pozwolą na identyfikację spójnego fenotypu?

Czy istnieje jeden marker, który może być użyty do izolacji AFSCs lub AMSCs?

Populacje AFSCs i AMSCs są heterogenne i różnią się właściwościami fenotypowymi i molekularnymi. Metody izolacji mogą prowadzić do uzyskania homogennej populacji komórek.

AFSCs lub AMSCs mogą być wykorzystane jako narzędzia w medycynie regeneracyjnej: ustalenie warunków hodowli z minimalną ilością substancji pochodzenia zwierzęcego lub bez nich.

Marker Discovery
Wstępna charakterystyka AFSCs i AMSCs może być przeprowadzona poprzez analizę immunofenotypową z wykorzystaniem dobrze scharakteryzowanych markerów powierzchni komórek, takich jak: CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58, CD44, HLA-ABC, SSEA-4; AMSCs: CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, Sox2, Tra1-60, Tra1-80, FGF-4, CFC-1, and PROM1.

Transcriptomics and Proteomics Revealed the Identification of Key Markers Expressed such as
AFSCs: Nanog, Sox2, POU5F1, NF2, IGF2, PLAU, OXTR, HHAT, RCS5, CDC2, COL2, TAGLN, Gsn, Anx4, GSTP, CK-19, Vim, Col1, and Gal; AMSCs: OGN, βIG-H3, i CD49F.
Ponieważ nie ma wspólnego markera dostępnego dla AFSC i AMSC, należy zastosować szerszy panel markerów. Skłania to również do przeprowadzenia dalszych szczegółowych analiz macierzowych i funkcjonalnych w celu określenia najbardziej odpowiednich markerów do charakterystyki AFSC i AMSC.

Konflikt interesów

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów.

.