Van 't Hoff zdobył swoją najwcześniejszą reputację w dziedzinie chemii organicznej. W 1874 r. wyjaśnił zjawisko aktywności optycznej, zakładając, że wiązania chemiczne między atomami węgla i ich sąsiadami są skierowane w stronę narożników regularnego czworościanu foremnego. Ta trójwymiarowa struktura tłumaczyła izomery występujące w przyrodzie. Ma w tym swój udział francuski chemik Joseph Le Bel, który niezależnie wpadł na ten sam pomysł.
Trzy miesiące przed uzyskaniem stopnia doktora, Van 't Hoff opublikował tę teorię, która dziś uważana jest za podstawę stereochemii, najpierw w holenderskiej broszurze jesienią 1874 roku, a następnie w maju następnego roku w małej francuskiej książce zatytułowanej La chimie dans l’espace. Niemieckie tłumaczenie ukazało się w 1877 roku, w czasie, gdy jedyną pracą, jaką Van 't Hoff mógł znaleźć, była praca w Szkole Weterynaryjnej w Utrechcie. W tych wczesnych latach jego teoria była w dużej mierze ignorowana przez społeczność naukową, a ostro krytykował ją jeden z wybitnych chemików, Hermann Kolbe. Kolbe napisał:
„A Dr J. H. van 't Hoff ze Szkoły Weterynaryjnej w Utrechcie nie ma upodobania, najwyraźniej, do dokładnego badania chemicznego. Uważał, że wygodniej jest wsiąść na Pegaza (najwyraźniej pożyczonego ze Szkoły Weterynaryjnej) i głosić w swojej 'La chimie dans l’espace’ jak, w swoim śmiałym locie na szczyt chemicznego Parnasu, atomy wydawały mu się ułożone w kosmicznej przestrzeni.”
Jednak około 1880 roku poparcie dla teorii Van 't Hoffa przez tak ważnych chemików jak Johannes Wislicenus i Viktor Meyer przyniosło uznanie.
W 1884 r. Van 't Hoff opublikował swoje badania nad kinetyką chemiczną, zatytułowane Études de Dynamique chimique („Studia nad dynamiką chemiczną”), w których opisał nową metodę określania kolejności reakcji za pomocą grafiki i zastosował prawa termodynamiki do równowagi chemicznej. Wprowadził też nowoczesne pojęcie powinowactwa chemicznego. W 1886 r. wykazał podobieństwo między zachowaniem rozcieńczonych roztworów i gazów. W 1887 r. założył wraz z niemieckim chemikiem Wilhelmem Ostwaldem wpływowe czasopismo naukowe Zeitschrift für physikalische Chemie („Journal of Physical Chemistry”). Pracował nad teorią dysocjacji elektrolitów Svante Arrheniusa i w 1889 r. przedstawił fizyczne uzasadnienie równania Arrheniusa. W 1896 r. został profesorem Pruskiej Akademii Nauk w Berlinie. Jego badania złóż soli w Stassfurcie były ważnym wkładem do pruskiego przemysłu chemicznego.
Van 't Hoff został wykładowcą chemii i fizyki w Wyższej Szkole Weterynaryjnej w Utrechcie. Następnie pracował jako profesor chemii, mineralogii i geologii na Uniwersytecie w Amsterdamie przez prawie 18 lat, zanim ostatecznie został przewodniczącym wydziału chemii. W 1896 r. Van 't Hoff przeniósł się do Niemiec, gdzie w 1911 r. zakończył karierę na Uniwersytecie Berlińskim. W 1901 r. otrzymał pierwszą Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii za swoją pracę nad roztworami. Jego praca pokazała, że bardzo rozcieńczone roztwory podążają za prawami matematycznymi, które ściśle przypominają prawa opisujące zachowanie gazów.