Immunohistochemia (IHC) jest potężną techniką opartą na mikroskopii, służącą do wizualizacji składników komórkowych, na przykład białek lub innych makrocząsteczek w próbkach tkanek. Siłą IHC jest intuicyjne wizualne wyjście, które ujawnia istnienie i lokalizację docelowego białka w kontekście różnych typów komórek, stanów biologicznych i/lub lokalizacji subkomórkowej w złożonych tkankach.
Technika IHC została wynaleziona w latach 40-tych (Coons, Creech, Jones, 1941) i jest rutynowo stosowana jako ważne narzędzie w opiece zdrowotnej i patologii np. w celach diagnostycznych lub do stratyfikacji pacjentów dla zoptymalizowanych schematów leczenia. IHC jest również szeroko stosowane w badaniach naukowych, gdzie analizuje się interesujące nas cząsteczki w celu zbadania ich roli zarówno w zdrowych, jak i chorych komórkach i tkankach na poziomie molekularnym, komórkowym lub tkankowym. Istnieje wiele różnych sposobów wizualizacji celów w tkankach przy użyciu IHC lub metod opartych na IHC, a także wiele protokołów dla różnych zastosowań i testów. Mimo że IHC jest generalnie solidną i sprawdzoną metodą, nowe testy często wymagają starannej optymalizacji w zależności od tkanki lub właściwości docelowego białka, cząsteczki wiążącej i/lub systemu reporterowego. Wiele lat rozwoju technicznego i ogromnie zwiększona dostępność specyficznych cząsteczek wiążących znacznie poprawiły użyteczność i obszary zastosowań IHC. Postęp w dziedzinie technik i odczynników opartych na IHC umożliwił naukowcom i pracownikom służby zdrowia uzyskanie bardziej precyzyjnych narzędzi, oznaczeń i biomarkerów. Ponadto, postęp techniczny umożliwił np. wysoce czułe jednoczesne wykrywanie wielu białek w tej samej próbce oraz wykrywanie interakcji białko-białko (patrz Proximity Ligation Assay).
Klasyczny test IHC jest przedstawiony na Rysunku 1 i obejmuje wykrywanie epitopów wyrażonych przez pojedyncze białko-cel w próbce tkanki przy użyciu „przeciwciała pierwotnego” zdolnego do wiązania tych epitopów z wysoką specyficznością. Po zdarzeniu wiązania epitop-przeciwciało, dodawane jest „przeciwciało drugorzędowe” zdolne do wiązania przeciwciała pierwszorzędowego z wysoką specyficznością. Przeciwciało drugorzędowe jest sprzężone z cząsteczką reportera i po zdarzeniu wiązania przeciwciało-przeciwciało dodawany jest substrat chemiczny, który reaguje z cząsteczką reportera w celu wytworzenia kolorowego osadu w miejscu całego kompleksu epitop-przeciwciało.
Rysunek 1. Podstawowa zasada immunohistochemii.
W schematycznej ilustracji (Rycina 1) utrwalony w formalinie, zatopiony w parafinie wycinek tkanki jest barwiony przy użyciu przeciwciała pierwotnego skierowanego na specyficzny cel białkowy. Do wycinka tkanki dodaje się roztwór zawierający przeciwciało pierwszorzędowe, a przeciwciałom daje się trochę czasu na znalezienie i związanie się z celem. Po tym etapie, niezwiązane i nadmiarowe przeciwciała są wypłukiwane i dodawane jest przeciwciało drugorzędowe. Przeciwciało drugorzędowe, które zawiera cząsteczkę łącznika z enzymami peroksydazy chrzanowej (HRP), jest również pozostawiane na pewien czas, aby związało się z przeciwciałem pierwszorzędowym, po czym następuje kolejny etap płukania. Po tym dodaje się 3,3′ diaminobenzydynę (DAB). Enzym HRP przekształca substrat DAB w brązowawy osad, który odkłada się w tkance w miejscu reakcji, tworząc w ten sposób wizualną reprezentację miejsca, w którym przeciwciało pierwotne po raz pierwszy związało się z celem.
Technologia
Przygotowanie tkanki
Tkanka odgrywa centralną rolę w eksperymencie i ważne jest, aby została przetworzona w sposób umożliwiający zachowanie epitopów i właściwej morfologii. Najczęstszym sposobem przetwarzania dla potrzeb IHC jest przygotowanie utrwalonych w formalinie bloczków tkankowych z zatopioną parafiną (FFPE). Celem utrwalania w formalinie jest chemiczne usieciowanie białek w obrębie tkanki. Powoduje to zakończenie wszystkich procesów komórkowych i zamrożenie składników komórkowych w miejscu i w takiej konformacji, w jakiej znajdowały się w momencie utrwalania, a także zapobiega ich degradacji. Po odpowiednim utrwaleniu tkanka jest poddawana dalszej obróbce i ostatecznie zatapiana w bloczkach parafinowych, które następnie są dzielone na cienkie plasterki (zwykle 4-10µm) za pomocą mikrotomu. Sekcje przenosi się na szklane szkiełka i pozwala się im przylgnąć przed dalszym przetwarzaniem.
Czasami stosuje się inne metody utrwalania poza formaliną. Należą do nich inne rodzaje aldehydów lub stosowanie różnych roztworów alkoholowych. Najlepszy wybór utrwalacza zależy w dużym stopniu od badania. Popularną alternatywą dla FFPE jest przygotowanie zamrożonych próbek tkanek. W tym przypadku tkanka jest zatapiana w medium krioprotekcyjnym i zamrażana, a utrwalanie odbywa się po sekcji. Tkanki mrożone są sekcjonowane w kriostatach i mają zaletę krótkiego czasu przetwarzania i lepszego zachowania wrażliwych epitopów, ale często mogą być gorsze od tkanek FFPE pod względem zachowania morfologii histologicznej.
Odzyskiwanie antygenu (epitopu)
Zagrożeniem związanym z utrwalaczami sieciującymi, takimi jak formalina, lub zbyt długim czasem spędzonym w medium utrwalającym jest maskowanie epitopów, które może przeszkadzać pierwotnemu przeciwciału w wiązaniu się z celem. Szczególnie w przypadku próbek FFPE, często istnieje potrzeba odwrócenia niektórych chemicznych wiązań sieciujących i „odzyskania” epitopów przed przystąpieniem do właściwego IHC. Istnieje kilka dostępnych protokołów odzyskiwania antygenów, a główne strategie obejmują traktowanie preparatu tkankowego ciepłem, enzymami trawiennymi, detergentami lub ich kombinacjami. Najczęstszą metodą odzyskiwania antygenów w próbkach FFPE jest gotowanie pod ciśnieniem szkiełek tkankowych w kwaśnym buforze cytrynianowym przez około 15-20 minut.
Wiązanie przeciwciał
Jakość i specyficzność cząsteczki wiążącej jest kluczowa dla każdej techniki opartej na IHC, a wybór wiązania może bezpośrednio wpłynąć na wynik, wiarygodność i prawdopodobnie również interpretację badania. Przeciwciała są zdecydowanie najczęstszym typem cząsteczki wiążącej używanej do IHC i chociaż większość przeciwciał jest w stanie odpowiednio wykryć właściwą cząsteczkę zainteresowania, mogą się one również znacznie różnić pod względem specyficzności dla zamierzonego celu. Przeciwciała o wysokiej specyficzności są zatem bardziej wiarygodne przy interpretacji wiązania „na celu”, ponieważ wytwarzają niewiele lub wcale wiązania „poza celem” lub „tła”. Przeciwciała, które są mniej specyficzne mogą wytwarzać więcej wiązań „off-target”, a wynikające z tego tło może zakłócać prawidłową interpretację prawdziwych sygnałów „on-target”. Istnieją dwa główne typy przeciwciał: przeciwciała poliklonalne, które są heterogeniczną mieszaniną przeciwciał wiążących różne epitopy na celu i przeciwciała monoklonalne, które wszystkie wiążą ten sam epitop. Przeciwciała poliklonalne są często bardzo silne ze względu na ich zdolność do wykrywania i wiązania wielu epitopów na tym samym celu. Jednakże, wiązane przez nie epitopy są często słabo zdefiniowane, a wraz z wieloma i różnymi swoistościami epitopów wzrasta prawdopodobieństwo wystąpienia zdarzeń wiązania poza celem i szumu tła. Jednakże, siła działania przeciwciał poliklonalnych może być korzystna, ponieważ stężenie zdarzeń wiążących wokół cząsteczki docelowej zwykle przewyższa potencjalny szum tła. Wadą jest to, że przeciwciała poliklonalne są zwykle ograniczonymi zasobami, ponieważ pochodzą one z surowic zwierzęcych. Przeciwciała monoklonalne, w przeciwieństwie do nich, mają większą ciągłość, ponieważ mogą być produkowane w liniach komórkowych hybridoma. Przeciwciała monoklonalne są również często dobrze zdefiniowane pod względem wiązania epitopu, ale nadal mogą generować wyniki, które są trudne do zinterpretowania, jeśli specyficzność jest niska lub jeśli docelowy epitop jest obecny w niskiej obfitości.
Potrzebna jest staranna optymalizacja i miareczkowanie stężenia przeciwciał dla każdego badania, ponieważ wynik zależy nie tylko od swoistości i powinowactwa przeciwciała do celu, ale także od stężenia i dostępności epitopów docelowych i potencjalnych epitopów pozacelowych obecnych w próbce. Dodanie zbyt dużej ilości przeciwciał do próbki zwiększy liczbę możliwych zdarzeń wiążących o niskim powinowactwie poza celem, gdy epitop(y) będą nasycone wiązaniami. Poprzez obniżenie stężenia przeciwciał, zdarzenia wiązania poza celem stają się rzadsze, ponieważ zwykle mają niższe powinowactwo niż zdarzenia wiązania na celu. Ryzyko przy próbie zmniejszenia tła przy użyciu przeciwciała o niskim powinowactwie polega na tym, że sygnały „na celu” są jednocześnie osłabione do tego stopnia, że dają wynik fałszywie ujemny.
Inne typy cząsteczek wiążących używanych czasami w technikach opartych na IHC obejmują afibodie, peptydy, fragmenty przeciwciał lub inne małe cząsteczki.
Systemy detekcji
Całym celem wykonywania IHC jest uzyskanie wizualnej reprezentacji tego, gdzie cel można znaleźć w tkance doświadczalnej, a najlepiej również uzyskanie informacji o wzorze ekspresji celu w heterogenicznych populacjach komórek i/lub lokalizacjach subkomórkowych. Przykładem tego jest Rysunek 2, który ilustruje, jak różne przeciwciała są używane do wizualizacji różnych przedziałów komórkowych lub tkankowych w obrębie złożonej tkanki. Aby zwizualizować interakcję cel-przeciwciało, potrzebny jest jakiś system detekcji, który wytwarza obserwowalną plamę lub sygnał. Najczęstszą metodą wprowadzenia systemu detekcji do eksperymentu jest użycie przeciwciała wtórnego, które przenosi wstępnie związaną cząsteczkę reportera, np. enzym lub fluorofor. Przeciwciała drugorzędowe są zwykle ukierunkowane specjalnie na cząsteczki przeciwciał z innego gatunku zwierząt. Na przykład, jeśli przeciwciało pierwotne jest hodowane u królika, to przeciwciało wtórne musi być hodowane u innego zwierzęcia i ukierunkowane specyficznie na przeciwciała królicze.
| Przełyk | Powiększenie | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Barwienie hematoksyliną | Barwienie błoniaste | ||||
| G6PD HPA000247 |
Barwienie cytoplazmatyczne | ||||
| LAMB2 (Laminina) CAB000053 |
Tkanka łączna |
Rysunek 2. Wizualizacja różnych celów białkowych w złożonych tkankach. Prawa kolumna pokazuje powiększenie odpowiednich obrazów w lewej kolumnie.
W obrazie IHC (Rysunek 2), kolejne sekcje ludzkiego przełyku barwione przy użyciu czterech różnych przeciwciał pozwalają na bezpośrednie porównanie różnych wzorców ekspresji białek w tkance i w obrębie przedziałów subkomórkowych. Górne obrazy są tylko przeciwbarwione hematoksyliną dla porównania. Przeciwciało p63 wybarwia jądra komórkowe w populacji komórek, które rezydują w podstawowej części nabłonka przełyku. Przeciwciało EGFR (Epidermal growth factor receptor) wydaje się barwić tę samą populację komórek co p63, ale barwi błony komórkowe zamiast jąder. Przeciwciało G6PD (dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa) wybarwia cytoplazmę szerszego repertuaru komórek nabłonka przełyku, a także komórek rezydujących w tkance łącznej. Przeciwciało Laminina (LAMB2) wybarwia tylko komórki i struktury w tkance łącznej leżącej u podłoża przełyku.
W przypadku próbek tkanek FFPE najczęstszą metodą wykrywania jest wykorzystanie reakcji enzymatycznych do wytworzenia kolorowego osadu w miejscu wiązania przeciwciał. Przeciwciała drugorzędowe przenoszą następnie enzym, np. peroksydazę chrzanową (HRP) lub fosfatazę alkaliczną (AP), które są zdolne do przekształcenia chromogenów takich jak 3,3′ diaminobenzydyna (DAB) lub fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolilu/chlorek p-nitroblue tetrazolu (BCIP/NBT) w brązowe lub niebieskawe osady, które odkładają się w tkance w miejscu reakcji. Barwniki chromogenne można obserwować w mikroskopie świetlnym i są one zazwyczaj bardzo stabilne w długich okresach czasu, co jest korzystne, jeśli eksperyment musi być zarchiwizowany lub przejrzany w późniejszym czasie.
W przypadku mrożonych wycinków tkanek bardziej powszechne jest stosowanie przeciwciał drugorzędowych powiązanych z fluoroforami, które emitują specyficzny kolor (zazwyczaj zielony, czerwony lub niebieski), gdy są wzbudzane przez światło o odpowiedniej długości fali. Ponadto, fluorofory zwykle nie są stabilne przez długi czas. Jednak zaletą stosowania fluoroforów jest to, że zapewniają one łatwą metodę wykonywania eksperymentów podwójnego znakowania, w których kilka przeciwciał skierowanych przeciwko wielu celom jest oznaczanych w tej samej próbce. Przeciwciała drugorzędowe muszą być ukierunkowane na różne przeciwciała pierwszorzędowe, a także muszą być sprzężone z różnymi fluoroforami. Różne przeciwciała drugorzędowe są następnie obserwowane oddzielnie przez sekwencyjne wzbudzanie ich różnymi długościami fali światła. Te różne wyniki wzbudzenia są zapisywane jako oddzielne obrazy (lub kanały kolorów) i mogą być później nakładane na siebie w celu wnioskowania o współlokacji białek itp.
Używanie do wykrywania przeciwciał drugorzędowych przenoszących reporter jest samo w sobie krokiem wzmacniającym, ponieważ kilka przeciwciał drugorzędowych jest w stanie związać pojedyncze przeciwciało pierwszorzędowe, ale czasami pożądane są dalsze kroki wzmacniające w celu zwiększenia sygnału i czułości eksperymentu. W takich przypadkach, przeciwciało drugorzędowe może zamiast tego przenosić „cząsteczki łącznikowe”, na przykład polimery biotyny, które są w stanie rekrutować większą liczbę cząsteczek reportera w kolejnych etapach. Ta strategia wzmacniania sygnałów jest przydatna zarówno w enzymatycznych, jak i fluorescencyjnych metodach detekcji.
Barwienie przeciwne
Barwienie immunohistochemiczne z użyciem chromogenów często korzysta z zastosowania barwnika przeciwnego, który wzmacnia kontrast i ułatwia obserwację cech histologicznych. Najczęstszym rodzajem przeciwbarwnika stosowanego do próbek FFPE jest hematoksylina, która barwi cytoplazmę komórkową na blady niebieskawy kolor, a jądra komórkowe na ciemniejszy niebieskawy odcień. Barwienia fluorescencyjne zazwyczaj nie są kontrbarwione hematoksyliną, ponieważ metoda detekcji nie jest oparta na mikroskopii świetlnej. Zamiast tego najczęstszym sposobem uzyskania przeciwbarwienia dla fluorescencji jest znakowanie jąder komórkowych przez dodanie barwników fluorescencyjnych wiążących kwasy nukleinowe. Po właściwej reakcji immunohistochemicznej, jedynymi pozostałymi krokami są przykrycie i uszczelnienie próbki w celu jej ochrony i długotrwałego przechowywania. Najczęstszym sposobem jest „przyklejenie” szkiełka nakrywkowego do próbki przy użyciu dostępnych w handlu, specjalnie przygotowanych żywic.
Szczególne przykłady
IHC jest szeroko stosowana zarówno w badaniach naukowych, jak i w praktyce klinicznej. Projekt Human Protein Atlas (HPA) jest doskonałym przykładem tego, jak wysokowydajna analiza IHC jest wykorzystywana do mapowania na dużą skalę ludzkiego proteomu w wielu tkankach, nowotworach i komórkach. W projekcie HPA, usprawniony wewnętrzny łańcuch produkcji przeciwciał na dużą skalę ułatwia wytwarzanie specyficznych przeciwciał, które po przejściu podstawowych procedur charakteryzacji i walidacji są używane do systematycznego barwienia mikromacierzy tkankowych zawierających setki rdzeni tkankowych w ramach pojedynczego eksperymentu. System IHC stosowany przez HPA opiera się w dużym stopniu na standaryzacji protokołów i automatyzacji przy użyciu maszyn, ale ocena optymalnego miareczkowania dla każdego przeciwciała jest wykonywana ręcznie, zanim przeciwciało zostanie zatwierdzone do barwienia na pełnym zestawie tkanek. Każdy wybarwiony rdzeń tkanki jest opisywany w odniesieniu do barwienia immunohistochemicznego w tkankach i typach komórek, a następnie publikowany jako obraz o wysokiej rozdzielczości na portalu internetowym do swobodnego przeglądania przez każdego.
W praktyce klinicznej, IHC jest głównie używane w patologii, aby pomóc lekarzom w ocenie próbek tkanek w odniesieniu do zdrowych i lub chorych stanów, w celu ustalenia diagnozy i określenia podtypu molekularnego różnych typów nowotworów. Konkretnym przykładem diagnostycznego zastosowania IHC jest sytuacja, w której patolodzy otrzymują próbkę guza przerzutowego, a pochodzenie tkankowe guza pierwotnego jest nieznane. W takich przypadkach patolodzy używają panelu różnych przeciwciał, które celują w białka specyficzne dla danej tkanki, takie jak antygen specyficzny dla prostaty w przypadku raka prostaty, lub receptor estrogenowy w przypadku nowotworów ginekologicznych, lub cytokeratyna 20 w przypadku nowotworów przewodu pokarmowego (Gremel i in., 2014). Po dokonaniu szerokiej klasyfikacji stosuje się dodatkowe przeciwciała specyficzne dla danej tkanki, aby jeszcze dokładniej określić pochodzenie guza pierwotnego. Informacje te są przydatne do wyboru najlepszej lub najbardziej odpowiedniej strategii terapii lekowej i/lub zlokalizowania guza pierwotnego do radioterapii i/lub operacji.
Referencje i linki
Commonly used antibodies for cancer diagnostics:
Gremel G et al., A systematic analysis of commonly used antibodies in cancer diagnostics. Histopathology. (2014)
PubMed: 24330150 DOI: 10.1111/his.12255
A review on validating antibodies for IHC:
O’Hurley G et al., Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Mol Oncol. (2014)
PubMed: 24725481 DOI: 10.1016/j.molonc.2014..03.008
Antibodypedia – Otwarcie dostępna baza ogólnodostępnych przeciwciał i ich przydatności w różnych zastosowaniach:
Świat IHC – Protokoły, Forum, Produkty i więcej:
Klip YouTube ilustrujący IHC od BioGenexLaboratories:
.