Immunoassay Screening of Diphenhydramine (Benadryl®) in Urine and Blood Using a Newly Developed Assay

Abstract

Difenhydramina (DPH) jest powszechnie dostępnym bez recepty lekiem przeciwhistaminowym, który wywołuje senność i może potencjalnie powodować wypadki związane z prowadzeniem pojazdów pod wpływem narkotyków.wypadków związanych z prowadzeniem pojazdów pod wpływem narkotyków. Do tej pory nie istnieją komercyjnie dostępne immunologiczne zestawy przesiewowe do jej wykrywania w płynach biologicznych, takich jak mocz i/lub krew. Opisujemy nowo opracowany test immunologiczny ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) i informujemy o jego przydatności w analizie autentycznych próbek pobranych od ochotników. Test jest specyficzny dla wykrywania DPH i nie wykrywa blisko spokrewnionych leków przeciwhistaminowych, takich jak bromfeniramina, chlorfeniramina i doksylamina. Obserwuje się różną reaktywność krzyżową z niektórymi związkami trójcyklicznymi, ze względu na podobieństwo struktury łańcucha bocznego z DPH. Wewnątrz- i międzydobowa precyzja oznaczenia została określona jako mniejsza niż 10%. Test jest wysoce czuły i posiada zakres roboczy od 1 do 500 ng/mL dla moczu i od 1 do 250 ng/mL dla krwi. Test był dalej walidowany z autentycznymi próbkami moczu i krwi uzyskanymi od ochotników i z laboratoriów koronerów.

Wprowadzenie

Difenhydramina (DPH), 2-difenylometoksy-N,N-dimetyloetanamina, jest lekiem przeciwhistaminowym na bazie etanoloaminy. Był to jeden z pierwszych środków przeciwhistaminowych odkrytych w 1946 r. i jest szeroko stosowany w celu złagodzenia powszechnych objawów alergii. DPH wywiera swoje działanie poprzez blokowanie skutków działania histaminy w miejscach receptorów H1, a także jest inhibitorem CYP2D6 i środkiem depresyjnym ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Oprócz tego, że jest lekiem przeciwhistaminowym, jest również stosowany jako lek przeciwwymiotny, przeciwkaszlowy i uspokajający. Chociaż DPH jest skuteczny, ma kilka działań niepożądanych, w tym senność, upośledzenie ruchowe, szybkie bicie serca, niewyraźne widzenie i inne (1, 2), dlatego został zgłoszony jako czynnik ryzyka w niebezpiecznych sytuacjach związanych z prowadzeniem pojazdów (3-5). Interakcje DPH z innymi lekami i/lub alkoholem mogą dodatkowo zwiększyć ryzyko wypadków związanych z prowadzeniem pojazdów i ofiar śmiertelnych.

Leki przeciwhistaminowe są szeroko klasyfikowane jako leki przeciwhistaminowe pierwszej generacji, drugiej generacji i leki przeciwhistaminowe na receptę. Leki przeciwhistaminowe pierwszej generacji, do których zalicza się DPH (Benadryl™), są dostępne bez recepty i powodują znaczną senność. Pokrewne leki przeciwhistaminowe w tej klasie to chlorfeniramina (Singlet™), bromfeniramina (Dimetapp™) i doksylamina (Vicks NyQuil™). Innym lekiem przeciwhistaminowym pierwszej generacji jest sól 8-chlorotheophyllinate DPH, znana jako dimenhydrinate (Dramamine™), która jest przepisywana na chorobę lokomocyjną. Leki przeciwhistaminowe drugiej generacji obejmują loratadynę (Claritin™), desloratadynę (Clarinex™), akrywastynę (Semprex-D™), ebastynę (Kestine™), cetyryzynę (Zyrtec™) i feksofenadynę (Allegra™), które są alternatywą dla DPH nie wywołującą senności. Rysunek 1 przedstawia struktury chemiczne powszechnie stosowanych leków przeciwhistaminowych.

Wywołujące sen działanie DPH spowodowało jego połączenie z innymi lekami, takimi jak acetaminofen, w preparatach takich jak Tylenol PM™ lub z lekami udrożniającymi nos, takimi jak pseudoefedryna. Chociaż DPH jest jednym z najstarszych leków przeciwhistaminowych, jest łatwo dostępny bez recepty i jest bardziej skuteczny i szybko działający niż niektóre z najnowszych leków na receptę, stąd jego powszechne stosowanie (6). Etykieta ostrzegawcza na leku Benadryl wyraźnie wskazuje na niebezpieczeństwo prowadzenia pojazdów po zażyciu leku. Ponadto liczne badania wyraźnie dowiodły upośledzenia zdolności motorycznych i poznawczych związanych ze złożonym zadaniem prowadzenia pojazdów samochodowych po zażyciu DPH w porównaniu z lekami przeciwhistaminowymi drugiej generacji lub nawet alkoholem (7-12). Przeprowadzono również badanie dotyczące zwiększonego ryzyka urazów po zażyciu DPH w porównaniu z lekami przeciwhistaminowymi drugiej generacji (13). Badania te wyraźnie uzasadniają znaczenie badań przede wszystkim w kierunku DPH.

DPH jest dostępny w kilku formach dawkowania, w tym w płynie, tabletkach, kapsułkach, gumach do żucia i kremach do stosowania miejscowego. Sugerowana dawka dla dorosłych mieści się w zakresie 25-50 mg co 4-6 h, nie przekraczając 50-100 mg (1). Po zażyciu DPH jest szybko wchłaniany przez organizm, z maksymalną aktywnością obserwowaną po około 1 godzinie od zażycia leku. Okres półtrwania DPH wynosi około 2-9 h, a szczytowe stężenie w osoczu osiągane jest po około 1-4 h od przyjęcia dawki. Po podaniu pojedynczej dawki doustnej 50 mg, po 3 godzinach wykryto średnie szczytowe stężenie difenhydraminy w osoczu 83 ng/mL, które następnie zmniejszyło się do 9 ng/mL do 24 godzin (14). Pojedyncza doustna 100-mg dawka DPH powodowała średnie szczytowe stężenie w osoczu 112 ng/mL po 2 h od podania (15). Skuteczność leków przeciwhistaminowych obserwuje się przy stężeniach większych niż 25 ng/ml, senność można zaobserwować przy stężeniach 30-40 ng/ml, a upośledzenie umysłowe obserwuje się przy stężeniach powyżej 60 ng/ml (16). Stwierdzono, że terapeutyczne poziomy DPH we krwi wynoszą od 25 do 112 ng/mL, poziomy toksyczne wynoszą około 5000 ng/mL, a poziomy śmiertelne przekraczają 8000 ng/mL (3, 17). Odnotowano również kilka przypadków nadużywania DPH, które były dokumentowane przez wiele lat (18-20).

Metabolizm in vivo DPH powoduje, że około 30% dawki jest przekształcane do metabolitu N-desmetylowego, po czym powstaje metabolit N,N-didesmetylowy, a 13% dawki jest przekształcane do metabolitów acetylowych przez aminę. Niewielki odsetek ulega przekształceniu do kwasu difenylometoksyoctowego, a pozostały znaczny odsetek dawki jest wydalany w postaci niezmienionej jako lek macierzysty (21, 22). Metabolizm difenhydraminy przedstawiono na rycinie 2.

Tradycyjne metody badania DPH w ludzkim osoczu obejmowały kosztowną i czasochłonną ekstrakcję próbki, po której następowały procedury potwierdzające. Kilka grup zgłosiło zastosowanie różnych metod chromatografii gazowej (GC) do wykrywania DPH w osoczu i moczu (23-27). Istnieją również doniesienia na temat metod elektroforezy kapilarnej (28) i chromatografii cieczowej ze spektrometrem mas (LC-MS) (29), które zostały opracowane w celu wykrywania DPH. Dotychczas w literaturze nie było doniesień na temat badań przesiewowych w kierunku difenhydraminy przy użyciu ELISA lub innej metody immunologicznej. W niniejszej publikacji przedstawiamy pierwszą metodę przesiewową ELISA do wykrywania DPH w ludzkim moczu i krwi.

Uważa się, że standardową praktyką w laboratoriach toksykologicznych jest wykonywanie przesiewowych testów immunologicznych, w których próbki dodatnie są najpierw identyfikowane i dalej potwierdzane technikami GC-MS lub LC-MS. Jest to stosowane przez większość laboratoriów toksykologicznych jako strategia „koszt-zysk”, w przeciwieństwie do wykonywania droższej procedury potwierdzającej dla każdej otrzymanej próbki. W związku z tym przydatna byłaby wiarygodna metoda przesiewowa ELISA, którą można by zastosować do próbek z DPH związanych z wypadkami drogowymi i ofiarami śmiertelnymi. W tym celu toksykolodzy przedstawili zalecenia dotyczące DUID, w tym proponowaną wartość graniczną DPH wynoszącą 25 ng/mL we krwi i 50 ng/mL w moczu (30). Niniejsza praca opisuje solidną i dokładną metodę przesiewową ELISA dla DPH w ludzkim moczu i krwi zgodnie z tymi proponowanymi wytycznymi.

Doświadczalne

Materiały

Odczynniki i chemikalia. Difenhydramina pochodziła z Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), a difenhydramina-d3 (roztwór 100 μg/mL w metanolu) pochodziła z Cerilliant (Round Rock, TX). Specyficzne przeciwciało poliklonalne DPH zostało wyhodowane przez Immunalysis (Pomona, CA), a hapteny DPH i koniugaty znakowane peroksydazą chrzanową zostały zsyntetyzowane przez Immunalysis. Odczynnik substratowy 3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyna (TMB) używany do reakcji kolorymetrycznej otrzymano z firmy Pierce (Rockford, IL). Enzymy użyte w procesie to bydlęca tyreoglobulina (BTG) otrzymana z Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), peroksydaza chrzanowa (HRP) otrzymana z BBI Enzymes (Madison, WI) oraz albumina surowicy bydlęcej (BSA) otrzymana z Proliant Biologicals (Boone, IA). Wszystkie stosowane rozpuszczalniki były klasy HPLC, a wszystkie substancje chemiczne były klasy ACS i pochodziły z firmy Spectrum Chemicals (Gardena, CA). Do testu ELISA, wysokie kalibratory dla DPH w stężeniu 1000 ng/mL zostały przygotowane w syntetycznym moczu ujemnym i syntetycznej krwi ujemnej i przechowywane w temperaturze 4°C. Syntetyczny ujemny mocz i syntetyczna ujemna krew użyte w tym badaniu zostały opracowane ze składników znalezionych w tych odpowiednich matrycach i dopasowane do reakcji immunologicznych trzech ujemnych próbek ludzkiego moczu i krwi (31, 32). Syntetyczny negatywny mocz składa się z 0,1% roztworu BSA w dejonizowanej wodzie; z 0,2% żółtym barwnikiem FD&C #6, a syntetyczna negatywna krew składa się z zastrzeżonego preparatu Immunalysis.

Aparatura. Kolumny powinowactwa HiTrap protein G HP, które były używane do oczyszczania immunoglobuliny G (IgG), zostały zakupione od GE Healthcare (Pittsburgh, PA). Standardowe polistyrenowe płytki mikrotitracyjne (96 dołków) uzyskano od firmy Corning Costar (Corning, NY). Myjka do płytek mikrotitracyjnych Tecan Columbus Pro i czytnik płytek Tecan Sunrise zostały zakupione od firmy Tecan (San Jose, CA). Pipety używane w procesie opracowywania testów immunologicznych pochodziły od firmy Rainin Instruments (Oakland, CA). Potrójny kwadrupolowy MS 6410 i kolumna Zorbax Eclipse XDB C18 używana do analizy LC-MS-MS zostały zakupione od Agilent Technologies (Santa Clara, CA).

Metody

ELISA. Pierwszym krokiem w rozwoju metody ELISA było wytworzenie przeciwciał poliklonalnych, które opierały się na odpowiedzi immunochemicznej wybranego gatunku zwierząt na antygen specyficzny dla DPH. W tym celu króliki były najpierw immunizowane antygenem DPH składającym się z DPH skoniugowanego z bydlęcą tyreoglobuliną (BTG). Proces immunizacji i wykrwawiania królików został zlecony wyspecjalizowanemu ośrodkowi dla zwierząt. Surowica uzyskana od królików została oczyszczona we własnym zakresie metodą chromatografii powinowactwa poprzez elucję przez kolumny z białkiem G, w celu uzyskania oczyszczonej frakcji IgG. Specyficzna dla DPH poliklonalna IgG została następnie unieruchomiona na 96-dołkowych polistyrenowych płytkach mikrotitracyjnych. Nadmiar przeciwciała został odessany, miejsca wiążące wolne przeciwciało zablokowano 1% roztworem trehalozy w wodzie, a następnie płytki suszono w piecu próżniowym w temperaturze 37°C przez noc. Płytki były następnie przechowywane w szczelnie zamkniętym woreczku ze środkiem osuszającym, ponieważ bardzo ważne jest, aby nie były zawilgocone. Krzywa zależności dawka-odpowiedź w moczu DPH została najpierw przygotowana przez wzmocnienie ujemnego syntetycznego moczu w stężeniach 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250 i 500 ng/mL z roztworu podstawowego leku o wysokiej kalibracji. Krzywą krwi otrzymano przez wzmocnienie ujemnej krwi syntetycznej w stężeniu 1, 5, 10, 25, 50, 100 i 250 ng/mL z roztworu wysokiego kalibratora. Kalibratory te w krwi syntetycznej były następnie przed analizą dalej rozcieńczane w stosunku 1:10 100 mM buforem fosforanowym zawierającym 150 mM chlorku sodu (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,0). Wszystkie próbki krwi były podobnie rozcieńczane w stosunku 1:10 w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (pH 7.0). Próbki moczu były również rozcieńczane w stosunku 1:20 w 100 mM roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (pH 7.0). Kalibratory i próbki były następnie pipetowane w dwóch egzemplarzach do studzienek płytki mikrotitracyjnej, przy czym wielkość próbki wynosiła 10 μl zarówno dla moczu, jak i krwi. Następnie dodano 100 μl koniugatu enzymatycznego składającego się z difenhydraminy znakowanej HRP. Następnie płytkę pozostawiono do inkubacji na 1 godz. w ciemności, w temperaturze pokojowej. Następnie studzienki przepłukano sześciokrotnie 350 μl wody dejonizowanej przy użyciu myjki do płytek mikrotitracyjnych, odessano w celu usunięcia wody, a następnie odwrócono i spoliczkowano do sucha, aby usunąć resztki wody ze studzienek. Następnie do każdego dołka dodano chromogenny substrat TMB (100 μL) i płytkę inkubowano przez kolejne 30 minut w ciemności. Reakcję zatrzymano następnie za pomocą 100 μL 1 N kwasu chlorowodorowego, aby uzyskać żółte zabarwienie. Badanie jest kolorymetryczne, a absorbancja została odczytana przy podwójnej długości fali 450 nm i 650 nm przy użyciu czytnika płytek mikrotitracyjnych. Długość fali 650 nm mierzy absorbancję tła, którą czytnik płytek następnie odejmuje od absorbancji końcowej. Intensywność wytworzonego koloru jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia analitu w próbce.

LC-MS-MS. Do analizy wykorzystano pompę LC serii 1200 sprzężoną z 6410 triple-quadrupole MS pracującym w trybie dodatniej jonizacji elektrospray (ESI). Kolumnę LC-MS-MS stanowiła kolumna Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 × 50 mm × 1,8 µm). Próbkę do analizy przygotowywano w następujący sposób: do fiolki autosamplera dodawano 100 µl próbki moczu zawierającej 50 µl difenhydraminy-d3 (200 ng/mL). Próbki były bezpośrednio wstrzykiwane do LC-MS-MS przez autoinjector. Temperaturę kolumny utrzymywano na poziomie 60°C, a objętość nastrzyku wynosiła 5 µL. Faza ruchoma składała się z 0,2% kwasu octowego o pH 4 (rozpuszczalnik A) i metanolu (rozpuszczalnik B). Początkowo skład fazy ruchomej wynosił 100% A przy szybkości przepływu 0,7 mL/min przez okres 6 min, następnie zwiększono udział procentowy metanolu do 100%, po czym ponownie powrócono do 100% A po 7 min.

Temperatura gazu wynosiła 350°C, przepływ gazu 10 L/min, a ciśnienie nebulizatora utrzymywano na poziomie 50 psi. Jako gazu kolizyjnego użyto azotu, a napięcie kapilarne wynosiło 4000V. Dla każdego leku wybrano i zoptymalizowano dwa przejścia. Czas przebywania wynosił 50 ms, a optymalna energia fragmentatora wynosiła 80V dla wszystkich przejść. Ustalono, że optymalne napięcia energii zderzenia wynoszą 35V dla deuterowanego wzorca wewnętrznego (difenhydramina-d3), 15V dla przejścia pierwotnego i 30V dla przejścia wtórnego dla samej difenhydraminy. Stosunek przejścia kwalifikatora do przejścia kwantyfikatora został określony w przybliżeniu w połowie zakresu kalibracji: 100 ng/mL. Przejście dla difenhydraminy-d3 wynosiło 259,7 > 165,2; przejście pierwotne (kwantyfikujące) dla difenhydraminy wynosiło 256,7 > 167,2; przejście kwalifikujące (wtórne) 256,7 > 152,2. Nieoznakowana difenhydramina może rozpadać się na jony produktowe o m/z 167 lub 165 z jonu prekursorowego w zależności od zastosowanej energii zderzenia. Nasza procedura została zwalidowana przy zastosowaniu opisanych warunków. Granica wykrywalności (LOD) metody LC-MS-MS wynosiła 10 ng/mL i została określona jako najniższe stężenie wykrywalne przy stosunku sygnał/szum > 2.

Wyniki i dyskusja

Krzywa dawka-odpowiedź

Metoda wykorzystuje konkurencyjne wiązanie pomiędzy koniugatem enzymu i wolnym analitem w próbce dla stałej ilości miejsc wiążących przeciwciała, proporcjonalnej do ich stężenia w mieszaninie. Krzywe dawka-odpowiedź dla DPH zostały przygotowane w syntetycznym ujemnym moczu i syntetycznej ujemnej krwi w stężeniach opisanych wcześniej. B0 jest absorbancją ujemnego kalibratora, a B reprezentuje absorbancję poszczególnych poziomów kalibratora. Procentowy stosunek pojedynczego kalibratora do kalibratora ujemnego (B/B0) został obliczony dla każdego poziomu kalibratora i wykreślony w odniesieniu do stężenia leku (ng/mL) zarówno dla moczu, jak i krwi (Rysunek 3). Wartości B/B0 są odwrotnie proporcjonalne do stężenia leku w próbce, ponieważ im wyższe stężenie leku, tym mniej koniugatu lek-enzym wiąże się z przeciwciałem, dając w ten sposób niższą wartość absorbancji.

LOD i odcięcie

LOD testu DPH został określony jako najniższe stężenie, które może być dokładnie zmierzone przy użyciu opisanych parametrów testu. Trzy próbki autentycznego moczu wolnego od narkotyków zostały wzmocnione różnymi stężeniami DPH do 1 ng/mL, a następnie analizowane w dwóch egzemplarzach. Uzyskano najniższą wartość obliczoną z dwóch odchyleń standardowych i w oparciu o ten wynik określono LOD dla testu na 1 ng/mL. Stężenia odcięcia zostały zaprojektowane na 50 ng/mL dla moczu i 25 ng/mL dla krwi. Oba zostały ustalone jako optymalne punkty decyzyjne w oparciu o dwa odchylenia standardowe kalibratorów w liniowej części krzywej dawka-odpowiedź, jak również mając na uwadze zalecane wytyczne ustanowione w dziedzinie toksykologii.

Wybiórczość

Interferencje od związków pokrewnych i niepokrewnych badano poprzez wsypanie tych substancji do syntetycznego moczu ujemnego i uruchomienie ich w teście ELISA. W tabeli I przedstawiono dane dotyczące reaktywności krzyżowej ze związkami blisko spokrewnionymi pod względem struktury i aktywności farmakologicznej z difenhydraminą, które stwierdzono na poziomie lub poniżej 1% przy wartości granicznej testu wynoszącej 50 ng/ml. Orfenadryna, która jest środkiem zwiotczającym mięśnie, jak również środkiem przeciwhistaminowym, reagowała krzyżowo z testem na poziomie 42%, ponieważ ma bardzo podobną strukturę do DPH, aczkolwiek z jedną grupą podstawnika metylowego. Żaden z metabolitów DPH przedstawionych na rysunku 2 nie został przebadany jako substancja reagująca krzyżowo w tym teście, ponieważ nie były one dostępne w handlu w tym czasie.

Związki, które nie były związane z DPH, były również analizowane w stężeniach 100 000 ng/mL w teście. Tabela II pokazuje reaktywność krzyżową z tymi niespokrewnionymi związkami. Większość z tych związków nie zakłócała wykrywania DPH w teście. Ze względu na podobieństwa w strukturze łańcucha bocznego, kilka związków takich jak amitryptylina, chlorpromazyna, klomipramina, doksepina, imipramina i cyklobenzapryna wykazywały różny stopień reaktywności krzyżowej z testem. Metody potwierdzania powinny wykluczyć wszelkie fałszywie pozytywne wyniki wykryte przez test ELISA w wyniku tych substancji reagujących krzyżowo, które mogłyby zakłócać test DPH. Zbadano również wpływ matrycy z autentycznych próbek moczu i krwi wolnych od DPH w celu określenia ich wpływu na test. Nie zaobserwowano niepożądanych wyników fałszywie dodatnich spowodowanych matrycami moczu i krwi, gdy próbki moczu i krwi wolne od DPH, potwierdzone metodą LC-MS-MS, były badane przy użyciu testu.

Precyzja

Precyzje śróddzienne i międzydobowe testuELISA przeprowadzono tylko w syntetycznym moczu przy stężeniach 0, 5, 10, 25 i 50 ng/mL. Precyzja śróddzienna została obliczona jako współczynnik zmienności (CV%) z 8 analiz przeprowadzonych tego samego dnia (n = 8) i była mniejsza niż 10%, a precyzja międzydzienna (CV%) obliczona z 8 analiz dziennie w ciągu 10 dni (n = 80) i również okazała się mniejsza niż 10%. Dane te zostały przedstawione w tabeli III.

Stabilność i okres przydatności do użycia testów

Okres przydatności do użycia produktu można zdefiniować jako czas, w którym istotne cechy użytkowe są zachowane w określonych warunkach postępowania (33). Aby spełnić ten wymóg w odniesieniu do odczynników klinicznych, przeprowadzono przyspieszone badanie stabilności w celu określenia przybliżonego okresu przechowywania produktu handlowego. Koniugat enzymatyczny DPH-HRP był przechowywany w temperaturze 37°C przez okres 14 dni i w tym czasie badany w określonych odstępach czasu, a jego wydajność porównywano z chłodzonym koniugatem lek-enzym przechowywanym w temperaturze 4°C. Krzywa dawka-odpowiedź była prowadzona na poziomach kalibracji 10, 50, i 100 ng/mL w syntetycznym moczu przez okres 14 dni. Stwierdzono, że test wykazywał niemal identyczną odpowiedź na dawkę przez cały 2-tygodniowy okres przyspieszonego badania czasowego. Ten okres 14 dni badania w przyspieszonym czasie stanowi odpowiednik co najmniej 18 miesięcy stabilności w czasie rzeczywistym w temperaturze 4°C (33). Dane przedstawiono na rysunku 4.

Autentyczne próbki

W celu walidacji badania, próbki moczu zostały pobrane o różnych porach w ciągu tygodnia od pięciu ochotników, którzy są regularnymi użytkownikami leczniczymi difenhydraminy z powodu typowych objawów alergii. Wszystkich pięciu ochotników poproszono o wypełnienie kwestionariusza, w którym podano wszystkie przyjmowane przez nich leki, przy czym zauważono, że nie wymieniono żadnych innych leków. Zebrano 20 próbek, które najpierw poddano badaniu metodą ELISA, a następnie potwierdzono za pomocą LC-MS-MS. Wszystkie próbki moczu zostały wstępnie rozcieńczone w stosunku 1:20 100 mM buforem fosforanowym soli fizjologicznej (pH 7.0) przed wykonaniem testu ELISA. Sześć próbek okazało się negatywnych dla obu metod, podczas gdy 14 próbek było pozytywnych dla testu ELISA, z czego 1 próbka została potwierdzona jako negatywna przez LC-MS-MS. Może to wynikać z faktu, że ilość DPH obecna w tej próbce stwierdzona metodą LC-MS-MS była bliska wartości granicznej 50 ng/mL. Pozytywne próbki moczu zawierały DPH na poziomie od 60 do 700 ng/mL. Dziesięć kontrolnych próbek moczu zostało również przygotowanych poprzez wzmocnienie syntetycznego moczu negatywnego niskim i wysokim pozytywnym stężeniem difenhydraminy i dalej analizowanych w teście. Wszystkie wyniki były pozytywne metodą ELISA i korelowały z ich danymi potwierdzającymi LC-MS-MS.

Post mortem próbki zostały użyte do walidacji testu krwi. Dwadzieścia pośmiertnych próbek krwi uzyskano z laboratorium koronera hrabstwa LA. Wszystkie próbki krwi przed analizą zostały wstępnie rozcieńczone w stosunku 1:10 w 100 mM roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (pH 7.0). Wszystkie 20 próbek wykazało pozytywny wynik testu ELISA i zostało porównanych z danymi potwierdzającymi GC-MS, również dostarczonymi przez laboratorium koronera, które wykazały, że zawierały one szeroki zakres stężeń DPH pomiędzy < 100 i 870 ng/mL. Chociaż jedna próbka potwierdziła stężenie niższe niż granica oznaczalności GC-MS wynosząca 100 ng/mL, DPH został zidentyfikowany przy użyciu procedury ELISA. Celem tego badania była walidacja metody ELISA przy użyciu znanej procedury potwierdzającej, a nie próba interpretacji stężeń. Wniosek z tego badania jest taki, że test ELISA jest w stanie wykryć terapeutyczne poziomy DPH, jak również znacznie wyższe poziomy pośmiertne, a zatem mógłby być łatwo stosowany do celów przesiewowych DUID, jak również w przypadkach śmiertelnych.

Wnioski

DPH jest lekiem dostępnym bez recepty, który został powiązany z licznymi wypadkami związanymi z prowadzeniem pojazdów, jak również z wypadkami śmiertelnymi. Tak więc test ELISA byłby przydatny do określenia obecności leków dostępnych bez recepty, takich jak leki przeciwhistaminowe, w próbkach uzyskanych w sytuacjach związanych z prowadzeniem pojazdu. Niniejsza praca opisuje rozwój wysoce czułej i specyficznej metody przesiewowej ELISA dla difenhydraminy w moczu i krwi z precyzją <10%. Według najlepszej wiedzy autorów, jest to pierwsza metoda immunologiczna opracowana do wykrywania DPH w ludzkich płynach ustrojowych. Metoda ta jest zgodna z zalecanymi wytycznymi dotyczącymi wartości granicznej 50 ng/mL w moczu i 25 ng/mL we krwi dla przypadków DUID. Ważność metody została również zweryfikowana z autentycznymi próbkami moczu i krwi, a dane ELISA korelowały z wynikami potwierdzenia LC-MS-MS i GC-MS. Pomimo, że niektóre z analizowanych próbek pochodziły z przypadków pośmiertnych, wyniki uzyskane z nich w połączeniu z niską wartością LOD testu wyraźnie wskazują na możliwość zastosowania testu w przypadkach inwalidztwa drogowego, gdzie mogą być wykryte niższe ilości DPH. Zaobserwowano pewien stopień reaktywności krzyżowej z niektórymi związkami trójcyklicznymi, które są strukturalnie podobne do DPH; jednak wszelkie fałszywe wyniki pozytywne wynikające z obecności takich związków zostałyby wyeliminowane na etapie potwierdzenia. Dalsze badania muszą być przeprowadzone w celu wyeliminowania kwestii reaktywności krzyżowej ze związkami trójcyklicznymi i poprawienia tej z podobnymi lekami przeciwhistaminowymi.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze z Immunalysis Corporation. Chcielibyśmy podziękować Dr. Jamesowi Soaresowi i Panu Michaelowi Vincentowi za wnikliwe dyskusje podczas przygotowywania tego manuskryptu, Pani Cynthii Coulter za analizę LC-MS-MS próbek moczu, oraz Panu Danowi Andersonowi z laboratorium koronera hrabstwa LA za dostarczenie pozytywnych próbek krwi. Pragniemy również podziękować wszystkim ochotnikom, którzy dostarczyli próbki moczu.

.