H MODELS FOR TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF THE β-GLOBIN LOCUS
Genetyczne manipulacje locus β-globiny i wynikające z nich efekty na transkrypcję, wrażliwość na DNazę, acetylację histonów, itd, doprowadziły do opracowania dwóch głównych modeli wyjaśniających, w jaki sposób ten złożony locus jest regulowany (przeglądy, patrz Bulger i Groudine, 1999; Engel i Tanimoto, 2000; Fraser i Grosveld, 1998; Orkin, 1995). Modele te koncentrują się na tym, jak LCR i jego regiony flankujące funkcjonują w celu regulacji ekspresji i otwarcia locus.
Model pętlowy lub konkurencyjny twierdzi, że element delecyjny Hispanic (zawierający LCR) funkcjonuje poprzez bezpośredni kontakt z promotorem genu w locus β-globiny, który ma być wyrażony. Wykazano, że inicjacja transkryptu zachodzi tylko przy jednym promotorze w określonym czasie w danej komórce (Gribnau i in., 1998). Model ten wyjaśnia, że inicjacja pojedynczego promotora jest wynikiem współzawodnictwa promotorów o kontakt z LCR. Taki bezpośredni kontakt wymagałby oczywiście zapętlenia interweniującej chromatyny, ale jak dotąd nie ma bezpośrednich dowodów na istnienie takiego zapętlenia. Transgeny zawierające LCR i albo pojedynczy ludzki gen globiny płodowej (γ) albo dorosłej (β) wyrażały geny przez cały okres rozwoju bez specyficzności rozwojowej; jednakże transgeny zawierające LCR i oba geny przywracały normalną ekspresję rozwojową, wskazując, że konkurencja genów jest ważna dla prawidłowo regulowanej ekspresji (Behringer i in., 1990; Enver i in., 1990). Analiza transgenów zawierających dodatkową kopię genu β-globiny i promotora potwierdziła podobne wnioski. Gdy dodatkowa kopia była umieszczona w pobliżu LCR (zastępując embrionalny gen ∊-globiny), ulegała ekspresji od 10 do 100 razy wydajniej niż kopia genu β-globiny, która znajdowała się w normalnym miejscu, daleko w dół transgenu. Transkrypcja dodatkowej kopii została wykryta na wczesnym etapie rozwoju, kiedy tylko embrionalne geny globiny ulegają normalnej ekspresji. Kiedy dodatkowy gen β-globiny został wstawiony tuż przed normalną kopią, ekspresja obu kopii była w przybliżeniu równoważna. Co ważne, całkowity poziom transkrypcji transgenicznego genu β-globiny pozostawał stały niezależnie od położenia dodatkowej kopii i był w przybliżeniu równy ilości transkrypcji pochodzącej z endogennego genu β-globiny (Dillon i in., 1997). Inwersja klastra genów β-globiny w stosunku do LCR w konstrukcji transgenicznej spowodowała poważne zaburzenia ekspresji genów. β-globina ulegała ekspresji na wszystkich etapach rozwoju, podczas gdy gen embrionalny (∊) nie ulegał ekspresji w ogóle. Transkrypcja dwóch ludzkich genów γ-globiny była również zmniejszona, prawdopodobnie z powodu konkurencji z genami dorosłej globiny o LCR. W locus typu dzikiego poziomy transkryptu dwóch genów γ-globiny są różne. W odwróconym transgenie klastra genów β-globiny, poziomy ekspresji tych dwóch genów zostały odwrócone, co wskazuje na konkurencję (Tanimoto i in., 1999). Wyniki te przemawiają za tym, że bliskość LCR jest ważnym czynnikiem determinującym transkrypcję genów w locus β-globiny.
Model łączący proponuje, że bezpośredni kontakt między elementami regulatorowymi nie musi mieć miejsca. Proponuje się, aby region regulatorowy delecji Hispanic i inne nieznane elementy chromatyny służyły jako platformy dla propagacji otwartych struktur chromatyny w całym locus. Chromatyna byłaby otwierana i utrzymywana w tej konfiguracji przez kompleksy białkowe, które rozciągają się liniowo wzdłuż DNA. Kompleksy takie łączyłyby zatem LCR z promotorami. Odrębne promotory genów służyłyby do rekrutacji czynników rozwojowych i specyficznych dla poszczególnych genów w celu ich ekspresji. Analizy transgenów zawierających ludzki LCR i poszczególne geny, takie jak gen globiny embrionalnej (∊) i gen globiny płodowej (γ) wykazały, że prawidłowa rozwojowa ekspresja tych genów zachodzi przy braku jakiegokolwiek innego genu globiny (Dillon i Grosveld, 1991; Lloyd i in., 1992; Shih i in., 1990). Dane te wydają się być sprzeczne z innymi badaniami (Behringer i in., 1990; Enver i in., 1990). Przypuszczalnie różnice w konstrukcjach transgenicznych, a więc w tym, które dokładnie cis-aktywne elementy regulacyjne zostały włączone, wyjaśniają te rozbieżności. Konkurencja może być wyjaśniona przez model łączący, na przykład poprzez odwołanie się do elementów granicznych, które zapobiegają propagacji dostępności. Zaproponowano, że promotory genów globiny działają w tym charakterze i zapobiegają otwarciu locus downstream (Bulger i Groudine, 1999).
Każdy z tych modeli, lub ich kombinacja, może wyjaśnić modulację struktury chromatyny, która leży u podstaw komórkowej kontroli rearanżacji genów receptorów antygenowych. Model pętli dostarcza atrakcyjnego mechanizmu dla elementu działającego cis, aby wpływać na odległe elementy bez wymogu, że zaburza on strukturę chromatyny interweniującego DNA. Na przykład, bezpośrednia interakcja między intronowym enhancerem IgH a promotorem VH mogłaby selektywnie otworzyć strukturę chromatyny otaczającą RSS tego segmentu genu V i doprowadzić RSS w pobliże segmentu genu DJ. Model łączący zapewnia atrakcyjny sposób, dzięki któremu zmiany strukturalne w chromatynie mogą być propagowane od jednego elementu do objęcia całej domeny. Na przykład, dostępność locus TCRβ może rozpocząć się od enhancera i przesuwać się w górę rzeki przez segmenty genu D do segmentów genu V, umożliwiając stopniowy dostęp do RSS.
.