Gertruda Stein urodziła się w Allegheny, w Pensylwanii, 3 lutego 1874 roku, w rodzinie zamożnych niemiecko-żydowskich imigrantów. W wieku trzech lat jej rodzina przeniosła się najpierw do Wiednia, a potem do Paryża. W 1878 roku powrócili do Ameryki i osiedlili się w Oakland w Kalifornii. Jej matka, Amelia, zmarła na raka w 1888 roku, a jej ojciec, Daniel, zmarł w 1891 roku.
Stein uczęszczała do Radcliffe College od 1893 do 1897 roku, gdzie specjalizowała się w psychologii u znanego psychologa Williama Jamesa. Po opuszczeniu Radcliffe zapisała się na Uniwersytet Johnsa Hopkinsa, gdzie przez cztery lata studiowała medycynę, którą opuściła w 1901 roku. Stein nie otrzymała formalnego dyplomu żadnej z tych instytucji.
W 1903 roku Stein przeniosła się do Paryża z Alice B. Toklas, młodszą przyjaciółką z San Francisco, która miała pozostać jej partnerką i sekretarką przez całe życie. Para nie wróciła do Stanów Zjednoczonych przez ponad trzydzieści lat. Podczas I wojny światowej razem byli wolontariuszami, wożąc zaopatrzenie do szpitali we Francji.
Wraz z Toklas i jej bratem Leo, krytykiem sztuki i malarzem, Stein wynajęła mieszkanie na Lewym Brzegu. Ich dom, 27 rue de Fleurus, wkrótce stał się miejscem spotkań wielu młodych artystów i pisarzy, w tym Henri Matisse’a, Ezry Pounda, Pabla Picassa, Maxa Jacoba i Guillaume’a Apollinaire’a.
Była gorącą zwolenniczką „nowego” w sztuce, a jej literackie przyjaźnie rozrosły się do tak różnych pisarzy jak William Carlos Williams, Djuana Barnes, F. Scott Fitzgerald, James Joyce i Ernest Hemingway. To do Hemingwaya, że Stein ukuła wyrażenie „stracone pokolenie”, aby opisać pisarzy emigrantów żyjących za granicą między wojnami.
Do 1913 roku, Stein wsparcie malarzy kubistycznych i jej coraz bardziej awangardowe pisanie spowodowało rozłam z bratem Leo, który przeniósł się do Florencji. Jej pierwsza książka, Three Lives, ukazała się w 1909 roku. Czułe guziki” (Claire Marie) z 1914 r. ukazały głęboki wpływ nowoczesnego malarstwa na jej twórczość. W tych niewielkich poematach prozą obrazy i frazy łączą się ze sobą w często zaskakujący sposób – podobny do malarstwa kubistycznego. Jej pisarstwo, charakteryzujące się użyciem słów dla ich skojarzeń i dźwięków, a nie ich znaczeń, spotkało się z dużym zainteresowaniem innych artystów i pisarzy, ale nie znalazło szerokiej publiczności.
Najbardziej wpływowe dzieła Stein to The Making of Americans (1925); How to Write (1931); The Autobiography of Alice B. Toklas (1933), która była bestsellerem; oraz Stanzas in Meditation and Other Poems (1956). Sherwood Anderson we wstępie do Geography and Plays (1922) napisał, że jej pisarstwo „polega na przebudowie i całkowicie nowym przekształceniu życia, w mieście słów.”
Stein zmarła w American Hospital w Neuilly 27 lipca 1946 roku, na nieoperacyjnego raka.
.