00:00:07.25Hi my name is Jennifer Doudna from UC Berkeley
00:00:09.26and I I’m here today to tell you about how we uncovered
00:00:12.26a new genome engineering technology.
00:00:15.07This story starts with a bacterial immune system
00:00:20.12at means understanding how bacteria
00:00:22.14fight off a viral infection.
00:00:24.26It turns out that a lot of bacteria
00:00:28.04 ma w swoim chromosomie,
00:00:30.09 na co tu patrzysz
00:00:32.15 sekwencję powtórzeń pokazanych w tych czarnych diamentach
00:00:36.18, które są przeplatane sekwencjami
00:00:40.19. które pochodzą od wirusów
00:00:43.08 i zostały one zauważone przez mikrobiologów
00:00:46.20, którzy sekwencjonowali genomy bakterii, ale nikt nie wiedział
00:00:50.10 jaka może być funkcja tych sekwencji
00:00:53.06Dopóki nie zauważono, że mają one również tendencję do występowania
00:00:58.09 z serią genów, które często kodują białka
00:01:03.29, które mają homologię z enzymami, które robią interesujące rzeczy
00:01:09.03, takie jak naprawa DNA.
00:01:10.12Była to więc hipoteza, że ten system
00:01:14.04, który został nazwany CRISPR
00:01:16.08, co jest akronimem dla tego typu powtarzalnych locus
00:01:19.14, że te systemy CRISPR mogą być w rzeczywistości
00:01:22.29an acquired immune system in bacteria
00:01:26.00that might allow sequences to be integrated
00:01:29.06from viruses and then somehow used later
00:01:32.07to protect the cell from an infection
00:01:35.26with that same virus.
00:01:37.05So this was an interesting hypothesis
00:01:39.11and we got involved in studying this
00:01:41.18 in the mid 2000’s right after the publication
00:01:44.15 trzech prac, które wskazywały na
00:01:47.13 włączenie sekwencji wirusowych
00:01:50.00 do tych genomowych loci.
00:01:52.07 I tak to, co wyłoniło się w ciągu następnych kilku lat
00:01:55.17 było to, że w rzeczywistości te systemy CRISPR
00:01:58.08really are acquired immune systems in bacteria
00:02:01.18so until this point no one knew that bacteria
00:02:04.24could actually have a way to adapt
00:02:08.08 to viruses that get into the cell
00:02:10.29but this is a way that they do it
00:02:12.14and it involves detecting foreign DNA
00:02:15.17at gets injected like shown in this example
00:02:18.04 from a virus that gets into the cell
00:02:20.System CRISPR pozwala na integrację
00:02:26.06 krótkich fragmentów tych wirusowych cząsteczek DNA
00:02:29.15 do locus CRISPR
00:02:31.07, a następnie w drugim etapie
00:02:33.27, który jest tu pokazany jako biogeneza CRISPR RNA
00:02:38.20Te sekwencje CRISPR są faktycznie transkrybowane
00:02:42.20w komórce na fragmenty RNA
00:02:45.15, które są następnie wykorzystywane razem
00:02:48.23 z białkami kodowanymi przez geny CAS
00:02:52.09tymi genami związanymi z CRISPR
00:02:54.01 do tworzenia kompleksów zakłócających lub interferencyjnych
00:02:58.12, które mogą wykorzystywać informacje w postaci
00:03:01.17 tych cząsteczek RNA do parowania zasad
00:03:04.08 z pasującymi sekwencjami w wirusowym DNA.
00:03:07.18Więc bardzo sprytny sposób, który bakterie
00:03:10.12 wymyśliły, aby wziąć swoich najeźdźców
00:03:13.06 i obrócić informację o sekwencji przeciwko nim.
00:03:17.00Więc w moim własnym laboratorium
00:03:20.21 od dawna interesujemy się
00:03:23.09 zrozumieniem, w jaki sposób cząsteczki RNA
00:03:26.03 są używane, aby pomóc komórkom dowiedzieć się
00:03:32.00 jak regulować ekspresję białek
00:03:34.03from the genome.
00:03:35.05And so this seemed like also a very interesting
00:03:37.27example of this and
00:03:39.18we started studying the basic molecular mechanisms
00:03:42.24by which this pathway operates.
00:03:45.01A w 2011 roku pojechałem na konferencję naukową
00:03:49.23 i spotkałem moją koleżankę,
00:03:52.13Emmanuelle Charpentier, która jest pokazana na tym zdjęciu
00:03:56.10 po lewej stronie, a laboratorium Emmanuelle
00:03:58.14 pracuje nad problemami mikrobiologii i są
00:04:02.11szczególnie zainteresowani bakteriami
00:04:04.00, które są ludzkimi patogenami.
00:04:06.01Badała organizm o nazwie
00:04:08.03Streptococcus pyogenes, który jest bakterią
00:04:11.15, która może powodować bardzo poważne infekcje u ludzi
00:04:14.25 i co było ciekawe w tym robaku było to, że
00:04:16.25 ma system CRISPR i w tym organizmie
00:04:19.06there was a single gene encoding a protein
00:04:21.27known as Cas9
00:04:23.12at had been shown genetically to be required
00:04:26.09for function of the CRISPR system
00:04:28.16in Streptococcus pyogenes,
00:04:30.Ale nikt wtedy nie wiedział, jaka jest funkcja
00:04:33.05 tego białka.
00:04:34.20Więc zebraliśmy się razem i zwerbowaliśmy
00:04:37.20 ludzi z naszych laboratoriów badawczych
00:04:40.26 do rozpoczęcia testowania funkcji Cas9.
00:04:43.17Więc kluczowi ludzie w projekcie
00:04:45.20 są pokazani tutaj na zdjęciu
00:04:48.00 w centrum jest Martin Jinek
00:04:50.03, który jest współpracownikiem podoktorskim w moim własnym laboratorium
00:04:52.17, a obok niego w niebieskiej koszuli
00:04:54.22 jest Kryztof Chylinski, który był studentem
00:04:57.20 w laboratorium Emmanuelle
00:04:58.26 i tak ci dwaj faceci razem z
00:05:00.21Inesem Fonfarą, który jest po prawej stronie,
00:05:02.10a postdoc z Emmanuelle
00:05:04.01began doing experiments across the Atlantic
00:05:07.25and sharing their data.
00:05:10.09And what they figured out was that
00:05:13.06Cas9 is actually a fascinating protein
00:05:16.04that has the ability to interact with DNA
00:05:19.28and generate a double stranded break
00:05:22.02in DNA at sequences that match
00:05:25.06the sequence in a guide RNA
00:05:27.08and this slide what you are seeing
00:05:29.06is that the guide RNA
00:05:30.10and the sequence of the guide in orange
00:05:32.11at base pairs with one strand
00:05:34.18 of the double helical DNA
00:05:37.11and very importantly this RNA
00:05:39.28interacts with a second RNA molecule
00:05:42.09called tracr that forms a structure
00:05:46.03that recruits the Cas9 protein
00:05:47.29so those two RNAs and a single protein
00:05:50.13in nature are what are required
00:05:52.23for this protein to recognize
00:05:56.05what would normally be viral DNAs
00:05:58.11in the cell and the protein
00:06:01.13is able to cut these up,
00:06:02.14literally by breaking up the double helical DNA.
00:06:05.24And so when we figured this out
00:06:08.14we thought: wouldn’t it be amazing
00:06:10.26if we could actually generate a simpler system
00:06:13.29Tak jak zrobiła to natura
00:06:15.02 łącząc razem te dwie cząsteczki RNA
00:06:18.04, aby wygenerować system, który byłby pojedynczym białkiem
00:06:20.16 i pojedynczym przewodnim RNA.
00:06:22.28Więc pomysł polegał na tym, żeby w zasadzie wziąć
00:06:25.17 te dwa RNA, które widzisz na dalekiej stronie
00:06:29.29 slajdu, a następnie w zasadzie połączyć je razem
00:06:33.19, żeby stworzyć to, co nazywamy
00:06:35.04 pojedynczym prowadzącym RNA.
00:06:36.22So Martin Jinek w laboratorium
00:06:38.25made that construct
00:06:40.21and we did a very simple experiment
00:06:44.22to test whether we truly had
00:06:46.18a programmable DNA cleaving enzyme
00:06:49.29 i pomysł polegał na wygenerowaniu krótkich pojedynczych RNA prowadzących
00:06:54.04, które rozpoznają różne miejsca w kolistej cząsteczce DNA
00:06:59.24, którą tu widzicie
00:07:00.21 i RNA prowadzące zostały zaprojektowane
00:07:03.10to recognize the sequences shown by the red bars
00:07:06.17in the slide and the experiment was then
00:07:10.16 to take that plasmid, that circular DNA molecule
00:07:13.21and incubate it with two different restriction (or cutting) enzymes,
00:07:18.27one called SalI which cuts
00:07:21.23the DNA sort of upstream at the far end
00:07:25.05 of the DNA in this picture
00:07:26.12in the grey box,
00:07:27.19and the second site being directed
00:07:31.00 przez RNA-guided Cas9
00:07:33.13at these different sites shown in red.
00:07:35.16And a very simple experiment
00:07:37.19we did this incubation reaction
00:07:39.26with plasmid DNA and this is the result
00:07:43.24and so this is what you are looking at
00:07:45.28is an agarose gel
00:07:47.29at allows us to separate
00:07:49.16the cleaved molecules of DNA
00:07:51.20and what you can see is that in each of these reaction lanes
00:07:54.22we get a different sized DNA molecule released
00:07:58.12from this doubly digested plasmid
00:08:00.16in which the size of the DNA
00:08:03.29corresponds to cleavage at the different sites
00:08:06.11directed by these guide RNA sequences
00:08:08.26indicated in red
00:08:10.24so this was a really exciting moment
00:08:12.29actually a very simple experiment that was
00:08:15.15kingd of an „A ha!” moment
00:08:17.03when we said we really have a programmable DNA cutting enzyme
00:08:22.02and that we can program it with a short piece of RNA
00:08:24.15 to cleave essentially any double stranded DNA sequence
00:08:28.07so the reason we were so excited
00:08:30.23about an enzym that can be programmed
00:08:33.19 to generate double stranded DNA breaks
00:08:36.01at any sequence is because
00:08:39.00there was a long standing set of experiments
00:08:42.16 in the scientific community that showed
00:08:45.13at cells have ways of repairing double stranded DNA breaks
00:08:49.26at lead to changes
00:08:52.02 w informacji genomowej w DNA
00:08:55.21, więc to jest slajd, który pokazuje, że
00:08:58.20 po tym jak dwuniciowe przerwanie jest generowane
00:09:01.14 przez jakikolwiek rodzaj enzymu, który może to robić
00:09:04.13w tym system Cas9
00:09:06.05those double stranded breaks in a cell
00:09:09.07 are detected and repaired by two types of pathways
00:09:13.15one on the left that involves
00:09:17.26non-homologous end joining
00:09:20.07which the ends of the DNA are chemically ligated
00:09:24.07back together usually with introduction
00:09:26.18of a small insertion or deletion
00:09:28.25at the site of the break
00:09:29.27 and on the right hand side
00:09:32.01is another way that repair occurs
00:09:34.00through homology directed repair
00:09:37.22in which a donor DNA molecule
00:09:39.14at has sequences that match those
00:09:43.28flanking the site of the
00:09:45.12double stranded break can be integrated
00:09:48.05into the genome at the site
00:09:50.10of the break to introduce new genetic information
00:09:54.06into the genome
00:09:55.15so this had given many scientists
00:09:59.04the idea that if there were a tool
00:10:01.04or a technology that allowed
00:10:03.05scientists or researchers to introduce
00:10:06.12double stranded breaks at targeted sites
00:10:09.00in the DNA of a cell then together
00:10:12.12with all of the genome sequencing data
00:10:14.21that are now available we know the
00:10:16.10whole genetic sequence of a cell
00:10:18.21and if you knew where a mutation occurred
00:10:21.20at causes a disease for example
00:10:23.20you could actually use a technology like this
00:10:26.25 to introduce DNA that would fix a mutation
00:10:31.00or generate a mutation
00:10:32.23you might like to study in a research setting
00:10:35.04so the power of this technology is
00:10:38.28really the idea that we can now generate
00:10:41.20these types of double stranded breaks
00:10:43.17 w miejscach, które wybieramy jako naukowcy
00:10:46.17 programując Cas9, a następnie pozwalając
00:10:48.13 komórce na dokonywanie napraw, które wprowadzają
00:10:51.04 zmiany genomowe w miejscach tych przerw
00:10:54.Ale wyzwaniem było to, jak wygenerować te przerwy
00:10:58.11 w pierwszej kolejności i tak wiele
00:11:00.09 różnych strategii zostało stworzonych
00:11:03.24, aby to zrobić w różnych laboratoriach
00:11:05.15most of them, and I’m going to show
00:11:08.21two specific examples here
00:11:10.17one called zinc finger nucleases
00:11:12.25and the other TAL effector domains
00:11:15.02these are both programmable ways
00:11:18.08 do generowania dwuniciowych przerw w DNA
00:11:20.21, które będą polegać na białkowym rozpoznawaniu
00:11:23.29 sekwencji DNA, więc są to białka
00:11:26.06, które są modularne i mogą być generowane
00:11:29.12in different combinations of modules
00:11:31.22to recognize different DNA sequences
00:11:34.03it works as a technology
00:11:37.18but it requires a lot of protein engineering
00:11:40.24 to do so, and what is really exciting
00:11:43.16about this CRISPR/Cas9 enzyme
00:11:46.11 is that it is a RNA programmed protein
00:11:49.25so a single protein can be used for
00:11:52.09 any site of DNA where we
00:11:54.27would like to generate a break
00:11:56.13by simply changing the sequence
00:11:58.16of the guide RNA associated with Cas9
00:12:00.24so instead of relying on protein-based recognition
00:12:03.06 of DNA we relying on
00:12:06.04RNA-based recognition of DNA
00:12:08.26as shown at the bottom so what this means
00:12:11.03is that is just a system
00:12:12.18at is simple enough to use
00:12:15.15at anyone with basic molecular biology training
00:12:19.05 can take advantage of this system
00:12:20.29 to do do genome engineering
00:12:22.20and so this is a tool that really
00:12:26.06I think, fills out an essential
00:12:29.03and previously missing component
00:12:30.24 of what we could call biology’s IT toolbox
00:12:33.29at includes not only the ability
00:12:36.00 to sequence DNA and look
00:12:38.06at its structure, we know about
00:12:39.24the double helix since the 1950’s
00:12:42.00, a następnie w ostatnich kilku dekadach
00:12:44.18 stało się możliwe użycie enzymów
00:12:46.09 jak enzymy restrykcyjne
00:12:47.26 i łańcuchowej reakcji polimerazy
00:12:49.09 do izolacji i amplifikacji poszczególnych segmentów
00:12:52.19 DNA, a teraz z Cas9
00:12:55.10 mamy technologię, która umożliwia
00:12:57.15facile genome engineering
00:12:59.13at is available to labs around the world
00:13:03.07 dla eksperymentów, które mogą chcieć zrobić
00:13:05.08 i tak to jest podsumowanie technologii
00:13:10.11 systemu 2-składnikowego
00:13:11.29 polega on na parowaniu zasad RNA-DNA
00:13:14.16 dla rozpoznania
00:13:15.21 i co bardzo ważne z powodu sposobu
00:13:18.24that this system works it
00:13:19.28is actually quite straight forward
00:13:21.18to do something called multiplexing
00:13:24.20which means we can program Cas9
00:13:27.00with multiple different guide RNAs
00:13:28.23 w tej samej komórce, aby wygenerować
00:13:30.19multiple breaks and do things
00:13:32.06like cut out large segments of a chromosome
00:13:35.01and simply delete them in one experiment.
00:13:38.25And so this has led to a real explosion
00:13:42.03 w dziedzinie biologii i genetyki
00:13:45.19z wieloma laboratoriami na całym świecie
00:13:48.08adoptującymi tę technologię
00:13:49.25dla wszelkiego rodzaju bardzo interesujących
00:13:51.15i kreatywnych rodzajów zastosowań
00:13:53.13and this is a slide
00:13:54.24atat’s actually almost out of date now
00:13:56.11but just to give you a sense
00:13:57.14of the way that the field
00:14:00.07 has really taken off
00:14:01.08so we published our original work on Cas9
00:14:04.10w 2012 roku i do tego momentu
00:14:07.16 było bardzo mało badań
00:14:08.18 nad biologią CRISPR gdziekolwiek
00:14:11.12było to bardzo małe pole
00:14:12.19i wtedy możesz zobaczyć, że
00:14:13.27starting in 2013 and extending
00:14:16.09untill now there has been this
00:14:17.21incredible explosion in publications
00:14:20.16from labs that are using
00:14:22.09this as a genome engineering technology
00:14:24.01so it’s been really very exciting for me
00:14:26.25as a basic scientist to see what started
00:14:29.22as a fundamental research project
00:14:31.12turned into a technology that turns out
00:14:34.08 to be very enabling for all sorts
00:14:35.28 of exciting experiments
00:14:37.07and I just wanted to close by sharing
00:14:40.07with you a few things
00:14:42.17at are going on using this technology
00:14:44.17so of course on the left hand side
00:14:47.13lots of basic biology that can be done now
00:14:50.02 with the engineering of model organisms
00:14:53.03and different kinds of cell lines
00:14:55.02that are cultured in the laboratory
00:14:56.21to study the behavior of cells
00:14:58.13, ale także w biotechnologii, będąc w stanie
00:15:01.23 dokonać ukierunkowanych zmian w roślinach
00:15:05.15 i różnych rodzajach grzybów, które mogą być bardzo
00:15:07.11 użyteczne dla różnego rodzaju zastosowań przemysłowych
00:15:09.29 and then of course in biomedicine
00:15:12.14with lots of interest in the potential
00:15:14.14 to use this technology as a tool
00:15:17.03for really coming up with novel therapies
00:15:21.06for human disease I think is something
00:15:23.09that jest bardzo ekscytujący i jest naprawdę coś
00:15:26.05to jest na horyzoncie już
00:15:27.09i wtedy ten slajd tylko naprawdę wskazuje
00:15:30.20gdzie myślę, że będziemy widzieć to idąc
00:15:33.15in the future with a lot of interesting
00:15:36.20and creative kinds of directions
00:15:39.03that are coming along in different labs
00:15:41.02both in academic research laboratories
00:15:43.19but also increasingly in commercial labs
00:15:45.29, które umożliwią wykorzystanie tej
00:15:49.24technologii do wszelkiego rodzaju zastosowań
00:15:52.18, z których wielu nie mogliśmy sobie nawet
00:15:54.10 wyobrazić nawet dwa lata temu.
00:15:56.05Więc jest to bardzo ekscytujące i chcę po prostu wyrazić uznanie dla wspaniałego zespołu
00:16:01.10 osób, które były zaangażowane w pracę
00:16:04.22nad projektem ze mną i mamy
00:16:06.07had terrific wsparcie finansowe od różnych grup
00:16:11.00as well and it’s been a pleasure
00:16:13.00 to share this with you, thank you.
.