dNTP oznacza trifosforan deoksyrybozy nukleotydów stosowany w PCR do rozszerzania rosnącej nici DNA. dATP, dTTP, dGTP i dTTP są czterema powszechnymi dNTPs stosowanymi w PCR.
Funkcją dNTPs w PCR jest rozszerzanie rosnącej nici DNA z pomocą polimerazy Taq DNA. Wiąże się ona z komplementarną nicią DNA za pomocą wiązań wodorowych.
PCR jest techniką syntezy DNA in vitro. Celem wykonania PCR jest wygenerowanie wielu kopii interesującego nas fragmentu DNA, aby uwidocznić go pod elektroforezą żelową.
Celem PCR jest wykonanie milionów kopii DNA do różnych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie DNA lub mikromacierze DNA.
Reakcja łańcuchowa polimerazy jest niezrównanym narzędziem stosowanym w molekularnych badaniach genetycznych od momentu jej odkrycia. Szablon DNA, startery, bufor, polimeraza Taq DNA i dNTPs są składnikami PCR. Aby zrozumieć mechanizm PCR powinniśmy mieć do nauki znaczenie każdego składnika używanego w nim,
W tym artykule, Jesteśmy omawiając jeden z kluczowych składników PCR, który jest dNTPs. Przyjrzymy się również jego strukturze i dlaczego jest tak ważny.
Ponadto, porozmawiamy o mechanizmie interakcji dNTP i polimerazy Taq DNA oraz ich działaniu na rosnącą nić DNA.
Ponadto, porozmawiamy o mechanizmie interakcji dNTP i polimerazy DNA oraz ich działaniu na rosnącą nić DNA.
Czytaj dalej w artykułach związanych z PCR,
- Rola DMSO w PCR: DMSO a PCR enhancer
- Function of taq DNA polymerase in PCR
- PCR primer design guidelines
- Role of MgCl2 in PCR reaction
Key Topics:
What are dNTPs?
DNTP są sztucznymi nukleotydami używanymi w PCR do syntezy nowych nici DNA, podobnie jak w przypadku replikacji DNA. dATP, dTTP, dGTP, dTTP są powszechnymi nukleotydami obecnymi w mieszance do PCR.
Struktura dNTP:
Skrót dNTP oznacza trifosforan deoksyrybozy nukleotydów.
Po pierwsze, musimy zrozumieć kilka podstawowych terminologii, takich jak baza, nukleotydy, nukleozydy, rybonukleotydy, deoksyrybonukleotydy, dideoksyrybonukleotydy, aby zrozumieć dNTP. Są to podstawowe terminy rutynowo używane w genetyce, a mimo to ludzie źle je rozumieją.
Adenina i guanina to zasady purynowe, podczas gdy cytozyna i tymina to zasady pirymidynowe. Azotowe zasady nie mogą tworzyć DNA bezpośrednio. Szkielet fosforanowy i cukier pentozowy są dodatkowo wymagane do utworzenia cząsteczki DNA.
Nukleotyd składa się z cukru pentozowego, fosforanu i zasady azotowej. Jeden nukleotyd wiąże się z innym sąsiednim nukleotydem za pomocą wiązania fosfodiestrowego, natomiast jeden nukleotyd wiąże się z innym nukleotydem na przeciwległej nici DNA za pomocą wiązań wodorowych.
Obraz przedstawia strukturę trifosforanu deoksyrybozy, difosforanu i monofosforanu.
Read Further on the Structure of DNA: Historia DNA: Struktura i funkcja DNA
Fosforan obecny w nukleotydzie to trifosforan, (tri-trójka) gdy fosforan nie jest związany z nukleotydem (lub jest nieobecny), nazywany jest jako nukleozyd (nukleotyd bez fosforanu określany jest jako nukleozyd).
Gdy atom wodoru zastępuje grupę hydroksylową w cukrze pentozowym, cukier nazywany jest cukrem deoksy. DNA składa się z pentozowego cukru deoksy, podczas gdy RNA składa się z jedynego cukru rybozowego.
DNTPs są łańcuchem nukleotydów składającym się z rybozy, zasady azotowej i fosforanu.
Ponadto, ddNTPs różnią się od dNTPs.
Trójfosforan dideoksynukleotydu nie ma wolnej grupy 3′ OH, inna grupa 3′ OH cukru jest zastąpiona wodorem.
Stąd nie może powodować ekspansji rosnącej nici DNA. Tak więc te rodzaje ddATP, ddTTP, ddCTP i ddGTP są używane w sekwencjonowaniu DNA. Omówimy rolę ddNTP w sekwencjonowaniu szczegółowo w innym artykule.
DdNTP są używane w metodzie terminacji łańcucha, aby zatrzymać ekspansję syntezy DNA.
Obraz przedstawia różnicę między cukrem rybozy, cukrem dezoksyrybozy i cukrem dezoksyrybozy.
Trójfosforan składa się z trzech różnych cząsteczek fosforanu, który stanowi szkielet dla DNA.
Szkielet fosforanowy DNA ma trzy różne cząsteczki fosforanu zwane fosforanami alfa, beta i gamma. Kiedy jeden fosforan lub fosforan gamma jest zwolniony, struktura jest nazywana difosforan deoksynukleotydów.
Podobnie, gdy dwa z trzech fosforanów zwolniony struktura jest nazywana monofosforan deoksynukleotydów.
dATP i dGTP są purynami, natomiast dCTP i dTTP są pirymidynowymi dNTP używanymi w reakcji PCR. Funkcja dNTPs w PCR jest taka sama jak w replikacji in vivo. Jeśli jesteś zainteresowany różnicami między nukleotydami a nukleozydami i purynami a pirymidynami przeczytaj te artykuły:
- Puryny Vs Pirymidyny
- Nukleotydy Vs Nukleozydy
Obraz przedstawia cztery różne struktury dNTPs.
Funkcje dNTPs:
DNTPs są składnikami PCR, RT-PCR, sekwencjonowania DNA lub mikromacierzy DNA, które pomagają we wzroście DNA lub amplifikacji DNA.
Mechanizm działania:
Proces PCR jest podzielony na trzy etapy zależne od temperatury:
- Denaturacja
- Annealizacja
- Rozciąganie.
W etapie denaturacji, dwuniciowy DNA jest denaturowany do jednoniciowego DNA; W etapie annealingu, primer wiąże się dokładnie w miejscu, gdzie występuje jego sekwencja komplementarna i,
W etapie przedłużania, polimeraza Taq DNA dodaje dNTPs do rosnącej nici DNA.
Po otwarciu nici i związaniu się primera z jednoniciowym DNA, polimeraza Taq DNA rozpoczyna swoją aktywność katalityczną.
Polimeraza Taq DNA wykorzystuje jednoniciowy DNA jako substrat dla aktywności enzymatycznej i osiada na złączu primer-DNA.
Jeden koniec polimerazy Taq DNA wiąże się w pobliżu 3′ OH grupy startera oligonukleotydowego, kompleks ten nazywany jest kompleksem P- DNA.
Obraz przedstawia strukturę DNA z wiązaniami wodorowymi i wiązaniem fosfodiestrowym DNA.
W następnym kroku rozpoczęto dodawanie dNTP.
DNTP wiąże się z kompleksem P-DNA ze słabym powinowactwem, jeśli obecny jest dokładnie komplementarny nukleotyd. Wkrótce potem polimeraza DNA Taq przytrzymuje go i dochodzi do interakcji wiązania wodorowego między komplementarną zasadą a dNTP.
Tutaj, na początku, nie cały nukleotyd, ale baza (zasada azotowa) obecna na dNTP decyduje o tym, czy się związać, czy nie.
Po pierwsze, jeśli znajdzie komplementarną zasadę na szablonie ssDNA (A dla T i G dla C), utworzy między nimi wiązania wodorowe. Trzy wiązania wodorowe między C i G i dwa wiązania wodorowe między A i T są produkowane.
Od momentu utworzenia się wiązania wodorowego polimeraza Taq DNA dostosowuje wiązanie dNTP do rosnącej nici DNA poprzez utworzenie wiązania fosfodiestrowego. Teraz po utworzeniu wiązania fosfodiestrowego, polimeraza Taq DNA porusza się o jeden krok do przodu w celu dodania nowego dNTP.
Wiązanie fosfodiestrowe tworzy się pomiędzy 3′ OH primera i 5′ P dNTP.
Po utworzeniu wiązania wodorowego, polimeraza DNA Taq katalizuje reakcję poprzez usunięcie gamma i beta-fosforanu z trifosforanu dNTP. Po zakończeniu reakcji uwalniane są dwa pirofosforany (PPi).
Dokładna kinetyka tego, jak dNTP i polimeraza Taq oddziałują podczas reakcji PCR, wciąż nie jest znana.
Czytaj dalej o elektroforezie w żelu agarozowym,
- Elektroforeza w żelu agarozowym
- Barwnik ładujący żel DNA
- Rola EtBr w elektroforezie w żelu agarozowym
Stężenie dNTPs w PCR:
Ogólnie, dla reakcji PCR z 30 do 35 cyklami przebiegu, wystarczy 200μM każdego z dNTPs.
200μM każdego z nich, co oznacza, że w sumie 800μM mieszanki 4 dNTPs jest wykorzystywane w pojedynczej reakcji PCR. Musimy przygotować nasze stężenie robocze z roztworu podstawowego 100mM.
Jednakże w ostatnich czasach bardzo popularny i skuteczny jest gotowy do użycia mastermix. Gotowy do użycia mastermix zawiera wszystkie ważne składniki, takie jak mieszanka dNTPs, barwnik ładujący żel i polimeraza Taq DNA.
Jako, że jesteśmy studentami nauk ścisłych, musimy się zastanowić, jak przygotować roztwór roboczy z zapasu. Przypuśćmy, że musimy przygotować 2mM roztworu roboczego z 100mM roztworu podstawowego.
teraz,
Pamiętasz V1C1= V2C2?
Tutaj, dane stężenie C1 jest 100mM (co jest stężeniem dNTPs w magazynie)
V1 jest objętość podana jest nieznany (?)
C2 to wymagane stężenie = 2mM
V2 to wymagana objętość= 1000μL
Teraz V1C1= V2C2
V1= V2C2/ C1
V1= 1000 * 2/ 100
V1= 20μL
Tutaj, 20μL każdego z dNTPs potrzebnych do przygotowania roztworu roboczego, więc końcowa objętość dla naszej mieszaniny to 80μL (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) w 920μL D/W.
To spowoduje, że końcowe stężenie każdego dNTP wyniesie 2mM w 1000μL roztworu roboczego. Oblicz sam dla 200μM.
My ultimate guide for using dNTPs in PCR
Zawsze przygotuj dwie probówki z roztworem podstawowym i przechowuj wszystkie probówki w temperaturze -20°C.
Oblicz ile reakcji wykonasz w ciągu tygodnia, a następnie przygotuj roztwór roboczy z roztworu podstawowego i przechowuj go w temperaturze 4°C. Ponieważ wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie obniża aktywność dNTPs.
Zawsze nosić odblaski i utrzymywać sterylne warunki podczas przygotowywania roztworu roboczego, ponieważ zanieczyszczenie obcym DNA utrudni reakcję PCR.
Stężenie 200μM jest wystarczające dla reakcji PCR, jednakże dla PCR dalekiego zasięgu można użyć 2mM do 3 mM stężenia każdego dNTP.
Wraz ze wzrostem stężenia dNTP wzrasta szybkość wiązania niespecyficznego. Podobnie, niedobór dNTPs prowadzi do niekompletnych produktów PCR. Dlatego zawsze należy używać odpowiedniej ilości dNTPs.
Wnioski:
Podsumowując, Funkcja dNTPs w reakcji PCR jest równie ważna jak polimerazy Taq DNA.
Z pomocą Taq, dNTPs wiążą się z rosnącą nicią DNA i rozszerzają ją. Jeśli nie chcesz zajmować się tymi wszystkimi rzeczami, możesz użyć gotowego do użycia zestawu PCR, który jest bardziej preferowany. Musisz jednak nauczyć się ręcznej metody przygotowywania odczynników.