Frontiers in Oncology

Introduction

It is known that persistent infection with high-risk human papillomavirus (hr-HPV) is a necessary cause for cervical cancer and precancerous lesions (1, 2). Przy ujawnionej etiologii, rak szyjki macicy jest w wysokim stopniu możliwy do uniknięcia (3, 4). Kraje rozwinięte zaczęły stosować badanie hr-HPV w pierwotnych badaniach przesiewowych w kierunku raka szyjki macicy, samodzielnie lub w ko-testach z cytologią (5-8). Dowody wskazują, że programy przesiewowe oparte na HPV zapewniają większą ochronę przed stanem przedrakowym i rakiem szyjki macicy niż inne tradycyjne metody przesiewowe, takie jak cytologia (9-11). Ponieważ jednak większość zakażeń HPV może ulec samoistnemu wyleczeniu, badania HPV pozwalają zidentyfikować liczne zakażenia, które nie rozwiną się w stan przedrakowy lub raka szyjki macicy, zwłaszcza u młodych kobiet (12). Dlatego nie zaleca się wykonywania testów DNA HPV u kobiet poniżej 30 roku życia. Co więcej, pacjentki HPV-dodatnie kierowane na kolejne procedury mogą cierpieć z powodu niepotrzebnych inwazyjnych interwencji.

W Chinach w 2015 roku odnotowano 98 900 nowych przypadków i 30 500 zgonów z powodu raka szyjki macicy (13). Aby zahamować tendencję wzrostową zachorowań na ten nowotwór złośliwy, rząd chiński od 2009 roku zapewnia ogólnokrajowy program bezpłatnych badań przesiewowych w kierunku raka szyjki macicy dla kobiet mieszkających na obszarach wiejskich, z wykorzystaniem testu VIA/VILI, testu Papanicolaou (Pap) lub testu HPV (w miejscach pilotażowych), w oparciu o poziom rozwoju ekonomicznego i technologicznego (14). Jednakże, ze względu na charakter tych metod przesiewowych, dokładność diagnostyczna wymaga poprawy. Ponadto, biorąc pod uwagę dużą populację Chin, należy ocenić nowe narzędzie przesiewowe, zapewniające równowagę między czułością i swoistością.

Swoiste dla danej choroby markery molekularne raka szyjki macicy stanowią połączenie wysokiej czułości i wysokiej swoistości w wykrywaniu stanów przedrakowych szyjki macicy. Większość z tych markerów została zidentyfikowana w oparciu o mechanizm kancerogenezy związanej z HPV. Badanie HPV RNA opiera się na wykrywaniu HR-HPV E6 i E7 mRNA. Potencjał onkogenny infekcji HPV zależy od produkcji wirusowych onkoprotein E6/E7. Dlatego wykrycie transkryptów mRNA E6/E7 daje możliwość stworzenia specyficznego testu do wykrywania zmian przedrakowych.

W tym badaniu oceniliśmy kliniczną skuteczność testu HPV E6/E7 mRNA w wykrywaniu śródnabłonkowej neoplazji szyjki macicy wysokiego stopnia (CIN) i raka wśród chińskich kobiet.

Materiały i metody

Uczestnicy i procedury

To szpitalne badanie przeprowadzono w okresie od kwietnia do grudnia 2017 roku w prowincji Henan w Chinach. Zaproszono kobiety, które odwiedziły oddział ginekologii The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University (SAHZU) w celu wykonania kolposkopii. Kryteria włączenia były następujące: (1) kobiety w wieku od 25 do 64 lat; (2) brak historii raka szyjki macicy lub histerektomii; (3) brak klinicznych objawów ciąży lub 8 tygodni po przerwaniu ciąży; i (4) zrozumienie procedur badania i dobrowolnie uczestniczyły w badaniu. Badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board (IRB) szpitala Henan Cancer Hospital (HCH). Pisemna świadoma zgoda została uzyskana od każdego uczestnika.

Komórki złuszczone z szyjki macicy zostały uzyskane od kobiet podczas badania ginekologicznego. Próbkę utrwalano w 20 ml podłoża transportowego PreservCyt® (Hologic Inc., Marlborough, MA, Stany Zjednoczone) i przechowywano w temperaturze 4°C. Następnie lekarz ginekolog przeprowadzał badanie kolposkopowe. Kobiety z nieprawidłowym wynikiem kolposkopii poddawano biopsji celowanej. Jeśli wynik badania kolposkopowego był niezadowalający (połączenie szyjki macicy i kolumny nie było w pełni widoczne), wykonywano łyżeczkowanie szyjki macicy (endocervical curettage – ECC). Okazy komórek złuszczonych z szyjki macicy były transportowane do Cancer Institute and Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (CICAMS). Próbki podzielono na dwie porcje: 1,5 ml mieszaniny komórek do probówki EP do testu DNA HR-HPV i testu mRNA HPV E6/E7. Pozostały konserwant ze złuszczonymi komórkami był używany do testu cytologicznego ThinPrep (TCT) (Hologic Inc., Marlborough, MA, Stany Zjednoczone). System raportowania Bethesda był używany do cytologii przez starszego cytologa (15).

HR-HPV DNA Assay

Próbki mieszaniny komórek o objętości 400 μl z 1,5 ml probówek EP były używane do wykrywania DNA 14 typów hr-HPV (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, i 68) przez Cobas 4800 HPV assay (Roche, Basel, SUI). Podawał on wyniki zbiorcze dla 14 hrHPV oraz oddzielne wyniki dla HPV 16 i 18, jednocześnie (16). Cobas 4800 był testem opartym na PCR dla DNA HPV z amplifikacją hybrydyzacji kwasów nukleinowych, zgodnie z instrukcjami producenta. Negatywne i pozytywne kontrole jakości były ustawione w każdym teście. Jeśli wartość ct była większa niż 40, wynik uznawano za negatywny. W przeciwnym razie wynik był pozytywny. Wyniki pozytywne obejmowały trzy typy: HPV 16, HPV 18 i HPV inne (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, i 68).

Testowanie mRNA wirusa HPV E6/E7

Jednomililitrowe próbki z 1,5 ml probówek EP zostały użyte do wykrywania wirusowego mRNA E6/E7 z typów 14 hr-HPV w zbiorczym teście APTIMA HPV (Hologic Inc, Marlborough, MA, Stany Zjednoczone), zgodnie z instrukcjami producenta (17). Był to test trzyetapowy, obejmujący ekstrakcję mRNA, amplifikację i detekcję amplifikowanego produktu. Jeśli liczba kopii była większa lub równa 1,0, wynik uznawano za pozytywny. W przeciwnym razie wynik był negatywny.

Diagnostyka histopatologiczna

Tkanki z biopsji i ECC zostały wysłane do SAHZU w celu postawienia diagnozy histopatologicznej zgodnie z systemem raportowania śródnabłonkowej neoplazji szyjki macicy (CIN). Następnie histopatolodzy z HCH dokonywali przeglądu wszystkich slajdów. Wszelkie niespójne diagnozy patologiczne przesyłano do CICAMS w celu ich rozstrzygnięcia. Ostateczna diagnoza dla każdej kobiety była oparta na najgorszym odczycie z przeglądu panelowego. Wszystkie procesy wykrywania i diagnozowania były ślepe.

Analiza statystyczna

Końcowa diagnoza histopatologiczna została użyta jako złoty standard. Kobiety z rozpoznaniem TCT, w którym stwierdzono zmiany śródnabłonkowe płaskonabłonkowe niskiego stopnia (LSIL) lub gorsze (LSIL +), uznano za kobiety z pozytywnym wynikiem cytologii płynnej (LBC). Wyniki HPV DNA były stratyfikowane, w zależności od typów HPV: HPV16/18 (tj. HPV16 i (lub) HPV18 dodatnie), HPV-others (tj. dowolny z 12 typów hr-HPV dodatni z wyłączeniem HPV16 i HPV18) oraz HPV-total (tj. dowolny z 14 typów hr-HPV dodatni). Obliczono bezwzględne szacunki i 95% przedziały ufności (95%CI) wskaźników dodatnich, czułości, swoistości, dodatniej wartości predykcyjnej (PPV) i ujemnej wartości predykcyjnej (NPV). Różnice w ekspresji mRNA HPV w różnych grupach HPV obliczono za pomocą testu chi kwadrat lub dokładnego testu Fishera. Do określenia różnic w czułości i swoistości użyto testu McNemara. Poziom α ustalono na 0,05, a p < 0,05 (dwumiarowe) uznano za istotne statystycznie.

Wyniki

W sumie do analizy włączono 537 kobiet. Średnia wieku wynosiła 43,88 ± 10,97 roku. Rozpoznania LBC były: 183 (34,7%) prawidłowe, 135 (25,1%) atypowe komórki płaskonabłonkowe o nieokreślonym znaczeniu (ASC-US), 22 (4,1%) atypowe komórki płaskonabłonkowe nie mogą wykluczyć HSIL (ASC-H), 7 (1.3%) atypowa komórka gruczołowa (AGC), 82 (15,3%) LSIL, 75 (14,0%) śródnabłonkowa zmiana płaskonabłonkowa wysokiego stopnia (HSIL), 31 (5,8%) rak płaskonabłonkowy (SCC) i 2 (0,4%) adenocarcinoma in situ (AIS). Rozpoznania histopatologiczne były następujące: 298 (55,5%) prawidłowe, 30 (5,6%) śródnabłonkowa neoplazja szyjki macicy stopnia 1 (CIN1), 48 (8,9%) CIN2, 111 (20,7%) CIN3, 43 (8,0%) SCC i 7 (1,3%) AIS.

Tabela 1 pokazała korelację pomiędzy wykrywaniem mRNA i DNA w zależności od typów HPV. Całkowita zgodność obu testów wynosiła 90,7% (95%CI: 87,9, 92,9) przy wartości kappa 0,81. Pozytywne wskaźniki mRNA wynosiły 91,7%, 84,6% i 86,4% odpowiednio u kobiet HPV16/18, HPV-others i HPV-total. Wszystkie wskaźniki pozytywnego mRNA były wyższe u kobiet HPV-dodatnich niż u HPV-ujemnych w tej samej grupie typów HPV (wszystkie p < 0,001).

The HPV DNA, mRNA, and LBC positive rates increased with the severity of histopathology diagnosis, ranged from 25.5, 19.1, and 11.4% in normal to 100.0% in SCC, respectively. Odsetek pozytywnych wyników tych trzech testów w AIS wynosił odpowiednio 85,7, 85,7 i 100,0%. Te trzy testy miały podobny odsetek pozytywnych wyników w CIN3, SCC i AIS. Jednak odsetek pozytywnych wyników dla mRNA był stosunkowo niższy u kobiet z rozpoznaniem CIN2. Odsetek pozytywnych wyników HPV16 był najwyższy w CIN3, SCC i AIS w porównaniu z innymi grupami DNA HPV. Odsetki HPV18 dodatnich były niższe niż 7% we wszystkich zmianach płaskonabłonkowych, ale nieco wyższe (28,6%) w AIS (Tabela 2).

Tabela 3 przedstawia kliniczną skuteczność trzech testów w wykrywaniu zmian CIN2+ i CIN3+. Czułość dla mRNA w wykrywaniu CIN2+ i CIN3+ wynosiła odpowiednio 93,8% (95%CI: 89,7-96,4) i 95,7% (95%CI: 91,3-97,9), co nie różniło się od czułości wykrywania przez DNA (95,7% dla CIN2+, 96,3% dla CIN3+), ale była wyższa niż czułość wykrywania przez LBC (80,4% dla CIN2+ i 88,8% dla CIN3+). Swoistości dla mRNA w wykrywaniu CIN2+ (79,0% ) i CIN3+ (70,5% ) były istotnie wyższe niż swoistości wykrywane przez DNA (71,0% dla CIN2+, 62,8% dla CIN3+) (p < 0,05), ale niższe niż swoistości wykrywane przez LBC (84,5% dla CIN2+, 79,8% dla CIN3+). Wartości PPV dla mRNA do wykrywania CIN2+ i CIN3+ wynosiły 74,0% (95%CI: 68,4-78,9) i 58,1% (95%CI: 52,1-63,9), a NPV odpowiednio 95,2% (95%CI: 92,0-97,2) i 97,4% (95%CI: 94,8-98,8).

Tabele 4, 5 przedstawiają odsetek wyników pozytywnych i wyniki kliniczne trzech testów w różnych grupach wiekowych. Podsumowując, wszystkie testy wykazywały lepsze wyniki u kobiet w wieku powyżej 30 lat niż u kobiet młodszych. Test DNA HPV miał najwyższą czułość, a LBC najwyższą swoistość w wykrywaniu CIN2+ i CIN3+ u kobiet młodszych niż 30 lat.

Dyskusja

Przedstawione wyniki wykazały, że test mRNA i strzykawki DNA osiągnęły wysoką zgodność, bo aż 90,7%. Odsetek pozytywnych wyników HPV DNA, mRNA i LBC wzrastał wraz z ciężkością rozpoznania histopatologicznego, odpowiednio od 25,5, 19,1 i 11,4% w normie do 100,0% w SCC. Czułość dla mRNA w wykrywaniu CIN2 i CIN3+ wynosiła 93,8% i 95,7%, czyli była podobna do czułości wykrywanej przez DNA (95,7% dla CIN2+ i 96,3% dla CIN3+). Jednak swoistość dla mRNA (79,0% dla CIN2+ i 70,5% dla CIN3+) była znacznie wyższa niż swoistość dla DNA (71,0% dla CIN2+ i 62,8% dla CIN3+).

W tym badaniu test mRNA HPV E6/E7 i test DNA HPV wykazały wysoką zgodność. Spośród kobiet HPV 16/18 DNA pozytywnych, 91,7% było również pozytywnych w teście mRNA, co jest podobne do innych badań, które wykazały ogólną zgodność ponad 90% pomiędzy testem APTIMA HPV i testami HPV DNA (17, 18) i konsekwentnie wyższe wskaźniki pozytywnych wyników testu HPV DNA w różnych populacjach (19, 20). Odnotowaliśmy wyższy odsetek pozytywnych wyników u starszych kobiet niż u młodszych, co nieco różni się od wyników innych badań (21-23). To zróżnicowanie może być przypisane projektowi badania (tj. badanie szpitalne), co ogranicza ekstrapolację wyników na populację ogólną. Co ciekawe, odsetek niezgodności był wyższy u kobiet w wieku 30 lat lub młodszych (25,6% vs. 8,6%). Badania wykazały wyższy odsetek spontanicznych klirensów dla infekcji HPV u młodszych kobiet, co wskazywało na mniejszą możliwość integracji HPV (24).

Jak wiemy, testy HPV oparte na DNA wykrywają obecność lub brak DNA HPV. Jednak większość infekcji HPV jest przejściowa, usuwana spontanicznie w ciągu 1 roku, co nie prowadzi do rozwoju przedraka lub raka szyjki macicy (25). Ekspresja mRNA E6/E7 występuje tylko w aktywnie zakażonych komórkach i wzrasta podczas rozwoju i progresji CIN (26). Dlatego też test HPV mRNA powinien być bardziej specyficzny w wykrywaniu zmian szyjki macicy o wysokim stopniu zaawansowania. Nasze dane potwierdziły tę hipotezę. Stwierdziliśmy, że test mRNA był równie czuły jak test DNA, ale bardziej specyficzny w wykrywaniu stanów przedrakowych i raka szyjki macicy. Inni badacze wyciągnęli podobne wnioski zarówno w przypadku pierwotnych badań przesiewowych (20), jak i triage’u kobiet z niewielkimi nieprawidłowościami cytologicznymi (27). W naszym badaniu 50 kobiet miało rozbieżne wyniki pomiędzy testem DNA HPV i mRNA. Wśród nich 34 kobiety z wynikiem DNA + /mRNA- w porównaniu z 8 kobietami z wynikiem mRNA + /DNA- uznano za prawidłowe lub CIN1; 6 kobiet w porównaniu z 2 kobietami uznano za CIN2 lub CIN3; w przypadku raków nie zaobserwowano różnicy w wynikach testu. Zatem, gdyby zastąpić test DNA HPV testem mRNA, 34 kobiety nie zostałyby skierowane na niepotrzebną kolposkopię, ale 4 CIN2 i 2 CIN3 zostałyby przeoczone. Pomimo braku 6 przypadków nie utracono czułości, natomiast wzrosła swoistość. Literatura wskazuje, że 40-60% przypadków CIN2 ulega regresji w ciągu 2 lat (28, 29), a nie wszystkie przypadki CIN3 są prawdziwymi zmianami przednowotworowymi (30). Cook i wsp. stwierdzili również niski wskaźnik CIN2+ wśród kobiet mRNA-/DNA + (17). Dlatego ryzyko raka inwazyjnego dla tych 6 kobiet było niskie w krótkim odstępie czasu.

Oceniliśmy również wydajność testu u starszych i młodszych kobiet. Analiza specyficzna dla wieku wykazała, że trzy testy działały lepiej u kobiet starszych niż 30 lat. W oparciu o fakt, że młodsze kobiety ze zmianami CIN miały większą możliwość regresji, sugerujemy zachowawcze postępowanie u młodszych kobiet. Badania wykazały, że infekcje HPV były częste u młodych kobiet, jednak duża część z nich była infekcjami przejściowymi i mogła ulec samoistnemu ustąpieniu (31, 32). Krótki czas trwania większości zakażeń HPV u tych kobiet sugeruje, że związana z nimi dysplazja szyjki macicy powinna być leczona zachowawczo (12). Dlatego też test DNA HPV może nie być odpowiednią metodą przesiewową dla kobiet poniżej 30 roku życia, ze względu na wysoki odsetek wyników fałszywie dodatnich. Należy ocenić skuteczność przesiewową cytologii i E6/E7 mRNA kompleksowo u młodych kobiet. W naszym badaniu dane wykazały, że cytologia miała najwyższą swoistość u kobiet poniżej 30 roku życia, ale czułość jest niższa niż test DNA HPV. Jednak w przypadku E6/E7 mRNA wykazywało umiarkowaną skuteczność u kobiet poniżej 30 roku życia, które miały wyższą czułość niż cytologia i wyższą swoistość niż HPV DNA, co sugeruje, że badanie E6/E7 mRNA może być obiecującą opcją w badaniach przesiewowych u kobiet poniżej 30 roku życia.

Chociaż chińska Agencja Żywności i Leków zatwierdziła trzy profilaktyczne szczepionki przeciwko HPV (tj. Cervarix, Gardasil i Cecolin), zapobieganie rakowi szyjki macicy nadal opiera się na badaniach przesiewowych. W 2009 r. rząd chiński uruchomił ogólnokrajowy program bezpłatnych badań przesiewowych w kierunku raka szyjki macicy dla kobiet wiejskich. W 2015 roku test DNA HPV został po raz pierwszy wykorzystany jako podstawowe narzędzie przesiewowe w pilotażowych ośrodkach. Jednak ze względu na dużą populację, badania przesiewowe oparte na HPV DNA spowodowałyby nieuniknione ogromne fałszywie dodatnie wyniki, prowadząc do marnowania zasobów zdrowotnych i niepotrzebnego niepokoju. Obiecujące jest, że mRNA może być stosowane w krajowym programie badań przesiewowych w kierunku raka szyjki macicy w celu zmniejszenia liczby wyników fałszywie dodatnich bez utraty czułości.

W tym badaniu należy zwrócić uwagę na kilka ograniczeń. Po pierwsze, jest to badanie przekrojowe i nie mogliśmy ocenić ryzyka progresji zmian związanych z HPV E6/E7 mRNA. Jednakże, dokonaliśmy stratyfikacji danych według stopnia histologicznego, co dostarcza informacji na temat korelacji. Po drugie, ważne jest, aby zauważyć, że wyniki nie mogą być w pełni uogólnione na populację ogólną, ponieważ uczestnicy badania byli rekrutowani z ambulatorium w szpitalu.

Podsumowując, test APTIMA mRNA miał dobrą zgodność z testem Cobas 4800 HPV DNA z podobną czułością i wyższą specyficznością w wykrywaniu zmian szyjki macicy o wysokim stopniu zaawansowania. Obiecujące jest to, że mRNA może być stosowany w chińskim narodowym programie badań przesiewowych w kierunku raka szyjki macicy w celu zmniejszenia liczby wyników fałszywie dodatnich bez utraty czułości. Konieczne są dalsze badania w celu oceny wydajności klinicznej testu mRNA u młodszych kobiet w Chinach.

Oświadczenie o dostępności danych

Wszystkie zestawy danych wygenerowane dla tego badania są zawarte w artykule/materiale uzupełniającym.

Oświadczenie o etyce

Badania z udziałem ludzi zostały przejrzane i zatwierdzone przez rolę koekspresji mRNA wirusa HPV E6/E7 i białka p16/Ki-67 w przewidywaniu ryzyka raka szyjki macicy. Przez Komitet ds. Przeglądu Etyki Nauk o Życiu Uniwersytetu Zhengzhou. The patients/participants provided their written informed consent to participate in this study.

Author Contributions

S-KZ contributed to the design and wrote the manuscript. ZG przyczynił się do napisania i korekty manuskryptu. PW, M-MJ, and P-PG contributed to the investigation and HPV DNA test. L-NK i Z-NW przyczynili się do wykonania badania HPV mRNA. D-MZ brała udział w badaniu cytologicznym i histologicznym. QC i X-QC przeprowadzili analizę statystyczną. X-BS współtworzył koncepcję badania i asystował przy analizach statystycznych. Y-LQ i J-GZ pomogli w przygotowaniu pracy i pomagali w pisaniu manuskryptu. J-GZ asystował przy realizacji badania. Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję manuskryptu.

Funding

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81502475) and Science and Technology Project of Henan Province (Grant No. 172102310067).

Konflikt interesów

Autorzy oświadczają, że badania zostały przeprowadzone przy braku jakichkolwiek komercyjnych lub finansowych powiązań, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Wszystkim kobietom zaangażowanym w to badanie dziękujemy za udział. Doceniamy również wkład wszystkich odpowiednich lekarzy w to badanie oraz pomoc National Cancer Center, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences i Peking Union Medical College. Doceniliśmy również 32nd International Papillomavirus Conference (IPVC 2018) za zapewnienie platformy do przedstawienia abstraktu badania (tytuł: Clinical Performance of HPV E6/E7 mRNA test to Detect Cervical High-grade Intraepithelial Neoplasia and Cancer: A Hospital-based Study in China, IPVC8-0744 Poster Session).

Skróty

hr-HPV, wirus brodawczaka ludzkiego wysokiego ryzyka; VIA/VILI, badanie wzrokowe z użyciem kwasu octowego/ badanie wzrokowe z użyciem roztworu jodu Lugola; Pap, papanicolaou; SAHZU, Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University; IRB, Institutional Review Board; HCH, Henan Cancer Hospital; CICAMS, Cancer Institute and Hospital Chinese Academy of Medical Sciences; 95%CI, 95% przedziały poufności; ECC, endocervical curettage; TCT, test cytologiczny ThinPrep; CIN, śródnabłonkowa neoplazja szyjki macicy; LSIL, zmiana śródnabłonkowa płaskonabłonkowa niskiego stopnia; HSIL, zmiana śródnabłonkowa płaskonabłonkowa wysokiego stopnia; LBC, cytologia płynna; PPV, dodatnia wartość predykcyjna; NPV, ujemna wartość predykcyjna; ASC-US, atypowe komórki płaskonabłonkowe o nieokreślonym znaczeniu; ASC-H, atypowe komórki płaskonabłonkowe nie mogą wykluczyć HSIL; AGC, atypowa komórka gruczołowa; SCC, rak płaskonabłonkowy; AIS, adenocarcinoma in situ.

.