Gdy próbka biologiczna jest poddawana kriokonserwacji, ruchy molekularne i procesy komórkowe zwalniają do punktu zeszklenia, w którym wszelka aktywność ustaje, zachowując komórki, tkanki, a nawet całe organizmy na lata. W związku z tym nie jest zaskoczeniem, że kriokonserwacja jest podstawą większości nowoczesnych operacji biobankowania.
Ale chociaż koncepcja zamrażania jest prosta, proces fizyczny jest dość złożony. Sposób zamrażania lub witryfikacji może mieć dramatyczny wpływ na żywotność komórek i jakość próbki po powrocie do cieplejszych temperatur.
W serii wpisów na blogu, w których zagłębimy się w proces zamrażania, będziemy badać właściwości fizyczne lodu oraz główne zdarzenia związane z zamrażaniem i rozmrażaniem próbek (co jest równie ważne jak chłodzenie). W tym pierwszym poście zacznijmy od początku i przyjrzyjmy się pierwszemu etapowi zamrażania, nukleacji.
Czysta woda schłodzona poniżej punktu zamarzania może pozostać superchłodzoną cieczą, dopóki nie zostanie zaburzona. (Poniższe wideo świetnie ilustruje ten punkt i jest świetnym domowym eksperymentem naukowym do wypróbowania z dziećmi!)
Na filmie uderzenie butelki z wodą stanowi miejsce formowania się kryształków lodu, innymi słowy, miejsce nukleacji. Nukleacja jest procesem, w którym cząsteczki w cieczy zaczynają gromadzić się w małe skupiska, układając się w sposób, który określi strukturę krystaliczną ciała stałego. Istnieją dwa rodzaje nukleacji:
- Nukleacja heterogeniczna, która występuje, gdy lód zaczyna się tworzyć wokół miejsca nukleacji, takiego jak zaburzenie fizyczne, zanieczyszczenie (takie jak sól) w cieczy lub nieregularność w pojemniku. Ponieważ próbki biologiczne nigdy nie są czystą wodą, zawsze występuje w nich zjawisko nukleacji heterogenicznej.
- Nukleacja homogeniczna, która występuje, gdy lód tworzy się bez żadnego uprzednio zdefiniowanego miejsca nukleacji. Czysta woda zamarza w temperaturze około -39°C przy braku miejsc nukleacji. W praktyce jednak jednorodna nukleacja nie jest często spotykana ze względu na rzadkość występowania całkowicie czystej wody.
Według recenzji w czasopiśmie Cryobiology „Nukleacja lodu jest najważniejszą niekontrolowaną zmienną w konwencjonalnej kriokonserwacji, prowadzącą do różnic między próbkami w odzyskiwaniu komórek, ich żywotności i funkcji.” Autorzy zalecają kontrolowanie procesu nukleacji i wymieniają kilka metod zamrażania, z których wiele jest powszechnie stosowanych w zastosowaniach IVF:
- Seeding: Wprowadzenie zewnętrznego kryształu lodu w celu promowania nukleacji w określonej temperaturze. Aby zminimalizować ryzyko skażenia, posiewu dokonuje się obecnie przez wytworzenie zimnego miejsca na zewnątrz pojemnika, takiego jak zimne kleszcze na boku słomki.
- Nukleanty chemiczne: Kryształy nukleujące lód są zawarte w pożywce do próbek. Nukleanty chemiczne pozwalają na szeroką standaryzację w różnych typach próbek i stanowią aktywny obszar badań.
- Zamrażanie elektryczne: Do indukowania tworzenia lodu stosuje się prąd elektryczny o wysokim napięciu.
- Metody mechaniczne: Wstrząsanie, stukanie lub stosowanie ultradźwięków może być skuteczne do nukleacji, ale trudne do standaryzacji.
- Chłodzenie szokowe/zamrażanie z kontrolowaną szybkością: Narażenie próbki na szybki zestaw ramp temperaturowych może sprzyjać nukleacji. To właśnie robi zamrażarka o kontrolowanej szybkości, przeprowadzając próbki przez proces nukleacji.
- Zmiana ciśnienia: Nukleacja może być wywołana przez podniesienie ciśnienia w próbce, obniżenie temperatury, a następnie zwolnienie ciśnienia.
Dla doskonałego wprowadzenia do właściwości tworzenia lodu w systemach biologicznych i więcej na temat procesu nukleacji, sprawdź rozdział pierwszy przełomowego tekstu z 2004 roku „Life in the Frozen State,” wysoce zalecana lektura dla każdego, kto jest zainteresowany bardziej szczegółowym poznaniem tych procesów.
.